導(dǎo)讀
? iTRAQ/TMT定量蛋白組學(xué)技術(shù)
? iTRAQ/TMT標(biāo)簽分子組成
? iTRAQ/TMT技術(shù)原理

iTRAQ和TMT標(biāo)簽介紹

說(shuō)到iTRAQ和TMT很多人可能會(huì)以為這是兩中不同的定量組學(xué)技術(shù)，但其實(shí)呢，iTRAQ和TMT技術(shù)只是生產(chǎn)商不同，除了標(biāo)記規(guī)格和標(biāo)簽分子結(jié)構(gòu)有些許差異，標(biāo)記肽段的原理基本上是一樣的。其中iTRAQ由AB SCIEX所開(kāi)發(fā)，緊接著Thermo Fisher研發(fā)了TMT，二者只是專(zhuān)利不同，但是使用原理基本一致。

iTRAQ：Isobaric Tag for Relative and Absolute Quantitation
TMT：Tandem Mass Tag

iTRAQ-TMT標(biāo)簽結(jié)構(gòu)以及相對(duì)定量原理詳解－百泰派克生物

iTRAQ和TMT標(biāo)記實(shí)質(zhì)上就是一種化學(xué)體外標(biāo)記試劑，能夠特異性標(biāo)記蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)生的多肽。iTRAQ和TMT標(biāo)記的蛋白樣品規(guī)格不同，相比之下TMT能夠標(biāo)記更廣泛的樣品數(shù)，能夠同時(shí)定量分析多組蛋白樣品，少至2個(gè)蛋白樣品，多至10個(gè)蛋白樣品，TMT蛋白定量都能夠做到。通過(guò)標(biāo)記多組不同樣品，TMT和iTRAQ能夠同時(shí)比對(duì)正常組織樣品和腫瘤組織樣品的蛋白水平差異，以及精準(zhǔn)檢測(cè)腫瘤在發(fā)展的不同階段的蛋白水平變化。

雖然iTRAQ和TMT的標(biāo)記原理一樣，但是兩種標(biāo)簽的結(jié)構(gòu)卻有一些差異，接下來(lái)我們來(lái)看看ITRAQ和TMT的標(biāo)簽結(jié)構(gòu)一個(gè)各自的細(xì)微差異吧

iTRAQ與TMT的分子結(jié)構(gòu)比較

iTRAQ與TMT的分子結(jié)構(gòu)比較

從上圖來(lái)說(shuō)，我們可以看到iTRAQ和TMT標(biāo)簽在結(jié)構(gòu)上有著明顯的差異，但是也有著一些共同點(diǎn)，首先兩個(gè)標(biāo)簽都由報(bào)告基團(tuán)，平衡基團(tuán)以及肽反應(yīng)基團(tuán)組成，兩個(gè)標(biāo)簽的各自報(bào)告基團(tuán)和平衡基團(tuán)的總重都是一定的。另外，兩個(gè)標(biāo)簽的肽反應(yīng)基結(jié)構(gòu)也是一樣的。iTRAQ和TMT標(biāo)簽的差異在于平衡基團(tuán)的結(jié)構(gòu)，從下圖可以看到TMT的平衡基團(tuán)結(jié)構(gòu)比iTRAQ標(biāo)簽的更為復(fù)雜。iTRAQ標(biāo)簽的平衡基團(tuán)只有幾十Da，而TMT的平衡基團(tuán)接近200Da，這也是造成iTRAQ和TMT標(biāo)簽質(zhì)量差異的原因。

簡(jiǎn)單介紹完兩個(gè)標(biāo)簽的結(jié)構(gòu)后，我們?cè)僖詉TRAQ 4-plex標(biāo)簽為例，詳細(xì)認(rèn)識(shí)一下iTRAQ分子標(biāo)簽的結(jié)構(gòu)組成

iTRAQ分子結(jié)構(gòu)組成

iTRAQ 4-plex標(biāo)簽結(jié)構(gòu)

iTRAQ標(biāo)簽分子骨架由三部分核心組件構(gòu)成：報(bào)告基團(tuán)，平衡基團(tuán)和肽反應(yīng)基團(tuán)。其中，報(bào)告基團(tuán)和平衡基團(tuán)構(gòu)成等基團(tuán)。不同的iTRAQ標(biāo)簽的報(bào)告基團(tuán)的重量不同，4-plex標(biāo)簽的報(bào)告基團(tuán)重量分別是：114，115，116，117Da；平衡基團(tuán)的質(zhì)量分別是：31，30，29，28Da，使得4個(gè)iTRAQ標(biāo)簽的報(bào)告基團(tuán)總重都是145Da。另外一個(gè)核心組件就是肽反應(yīng)基團(tuán)，其主要的功能就是與多肽游離的N端氨基發(fā)生置換反應(yīng)，使同位素標(biāo)簽共價(jià)交連到肽段N端。 前面說(shuō)到標(biāo)簽報(bào)告基團(tuán)和平衡基團(tuán)的質(zhì)量，很多人可能會(huì)好奇，標(biāo)簽的報(bào)告基團(tuán)僅僅相差幾個(gè)Da，這是如何做到的呢？其實(shí)這就是利用了同位素標(biāo)記的原理。下面我們以iTRAQ標(biāo)簽為例進(jìn)行解釋。

如下圖，質(zhì)量為114的報(bào)告基團(tuán)包含1個(gè)C13，報(bào)告基團(tuán)質(zhì)量增加1Da。同時(shí)平衡基團(tuán)包含1個(gè)C13和1個(gè)O18，質(zhì)量總共增加3Da，因此，114標(biāo)簽的總質(zhì)量增加4Da。以此類(lèi)推，115的報(bào)告基團(tuán)增加2Da，平衡基團(tuán)增加2Da；116的報(bào)告基團(tuán)增加3Da，平衡基團(tuán)增加1Da；117的報(bào)告基團(tuán)增加4Da，平衡基團(tuán)增加0Da。以上四個(gè)標(biāo)簽通過(guò)對(duì)報(bào)告基團(tuán)和平衡基團(tuán)進(jìn)行不同的同位素標(biāo)記后，各自的報(bào)告基團(tuán)和平衡基團(tuán)的增加質(zhì)量不同，但是增加的總的質(zhì)量是一樣的，因此，標(biāo)簽的總重相等。

iTRAQ標(biāo)簽的同位素標(biāo)記

標(biāo)簽與肽段反應(yīng)的過(guò)程

肽段標(biāo)記反應(yīng)過(guò)程

iTRAQ相對(duì)定量研究原理

蛋白質(zhì)首先被裂解為肽段，然后用iTRAQ試劑進(jìn)行差異標(biāo)記。由于iTRAQ試劑是等量的，即不同同位素在標(biāo)記同一多肽后在第一級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)，分子量完全相同，用串聯(lián)質(zhì)譜方法對(duì)在第一級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)到前體離子進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離，產(chǎn)物離子通過(guò)第二級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行分析。在二級(jí)質(zhì)譜分析過(guò)程中，報(bào)告基團(tuán)、質(zhì)量平衡基團(tuán)和多肽反應(yīng)基團(tuán)之間的鍵斷裂，質(zhì)量平衡基團(tuán)丟失，產(chǎn)生低質(zhì)荷比(m/z)的報(bào)告離子。由于二級(jí)質(zhì)譜可分析相對(duì)分子質(zhì)量相差1的報(bào)告基團(tuán)，不同報(bào)告基團(tuán)離子強(qiáng)度的差異就代表了它所標(biāo)記的多肽的相對(duì)豐度。同時(shí)，多肽內(nèi)的酰胺鍵斷裂，形成一系列 b 離子和 y 離子，得到離子片段的質(zhì)量數(shù)，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢和比較，可以鑒定出相應(yīng)的蛋白質(zhì)前體。

iTRAQ定量分析原理

iTRAQ相對(duì)定量研究流程

iTRAQ定量分析流程

1. 對(duì)不同的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行酶切消化成多肽片段
2. 使用不同的iTRAQ標(biāo)簽對(duì)不同蛋白樣品消化產(chǎn)生的多肽片段分別進(jìn)行標(biāo)記，但是不同的iTRAQ標(biāo)簽的總質(zhì)量是一樣的。
3. 比例混合各個(gè)標(biāo)記后的樣品
4. 帶上標(biāo)記的多肽片段經(jīng)過(guò)一級(jí)質(zhì)譜分離，在一級(jí)質(zhì)譜中，iTRAQ標(biāo)簽由于總質(zhì)量數(shù)一樣，來(lái)自不同蛋白樣品的相同肽段不能被區(qū)分，因此會(huì)一起進(jìn)入二級(jí)質(zhì)譜分析
5. 在二級(jí)質(zhì)譜中，在高能碰撞下iTRAQ的平衡基團(tuán)會(huì)被打碎，因此報(bào)告基團(tuán)得到釋放，同時(shí)肽段也被釋放，碰撞碎裂成二級(jí)碎片。這時(shí)通過(guò)分析肽段的氨基酸序列，可以推測(cè)對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)的序列；同時(shí)各個(gè)報(bào)告基團(tuán)的在質(zhì)譜中的信號(hào)強(qiáng)度代表多肽在4組樣品中的相對(duì)豐度，即反應(yīng)相應(yīng)的蛋白質(zhì)在4組樣品中的相對(duì)表達(dá)水平。

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