T/HIFSA 0002-2023
《水質(zhì)微生物檢測(cè) 光電檢測(cè)法》

"Photoelectric Detection Method for Microbial Detection of Water Quality"

標(biāo)準(zhǔn)號(hào)

T/HIFSA 0002-2023

發(fā)布

2023年

發(fā)布單位

中國(guó)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

當(dāng)前最新

T/HIFSA 0002-2023

 

 

適用范圍

5　試驗(yàn)方法 菌落總數(shù)測(cè)定 5.1.1　原理  在37℃培養(yǎng)24 h后，水樣中的微生物通過(guò)新陳代謝產(chǎn)生酸堿度的變化，使菌落總數(shù)檢測(cè)試劑中的酸堿指示劑發(fā)生顏色變化，該顏色變化可以被肉眼捕捉，也可以被光電檢測(cè)儀的信號(hào)源捕捉，進(jìn)而完成測(cè)定。 5.1.2　儀器和設(shè)備 冰箱:2 ℃～5 ℃。 渦旋振蕩器。 無(wú)菌吸管:1mL(具0.01 mL 刻度)、5 mL(具0.1 mL 刻度)或微量移液器及吸頭。 恒溫培養(yǎng)箱:36 ℃±1 ℃。 微生物光電檢測(cè)系統(tǒng)（如FORBID-M光電檢測(cè)儀）。 光電檢測(cè)管（如FORBID-M光電檢測(cè)管）。 5.1.3　培養(yǎng)基和試劑  菌落總數(shù)快速檢測(cè)試劑:見(jiàn)附錄 2.1 菌落總數(shù)質(zhì)控菌株：大腸埃希氏菌 CICC 10389、金黃色葡萄球菌 ATCC 25923、銅綠假單胞菌 ATCC 9027。 5.1.4　 檢驗(yàn)程序  菌落總數(shù)的檢驗(yàn)程序見(jiàn)圖1。 圖 1 菌落總數(shù)檢驗(yàn)程序 5.1.5　操作步驟  培養(yǎng)基準(zhǔn)備 使用一次性無(wú)菌吸管或微量移液器及吸頭吸取菌落總數(shù)快速檢測(cè)試劑加入光電檢測(cè)管中，5 mL/管。 樣品的接種 使用一次性無(wú)菌吸管吸取1mL混勻后的樣品，注入已加好菌落總數(shù)快速檢測(cè)試劑的光電檢測(cè)管中并做好標(biāo)記。其中1支檢測(cè)管不加檢測(cè)樣品作為空白對(duì)照。 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 5.1.5.3.1　如需定量時(shí)，以滅菌處理后的無(wú)菌樣品做為稀釋基質(zhì)，使用渦旋振蕩器對(duì)菌落總數(shù)質(zhì)控菌株進(jìn)行十倍梯度稀釋，選擇5-7個(gè)適宜的稀釋梯度，按照5.1.5.1-5.1.5.4中的操作步驟使用微生物光電檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)按照GB 4789.2中的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板法進(jìn)行培養(yǎng)。 5.1.5.3.2　以儀器擬合拐點(diǎn)時(shí)間（h）為橫坐標(biāo)，平板計(jì)數(shù)結(jié)果對(duì)數(shù)值（log C）為縱坐標(biāo)建立線性相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)曲線，若線性相關(guān)系數(shù)滿足 R2 ≥ 0.98時(shí) ，即可將命名為菌落總數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線寫入儀器，反之則需重新建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。 5.1.5.3.3　若無(wú)需對(duì)結(jié)果定量時(shí)，則直接跳過(guò)5.1.5.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立步驟。 培養(yǎng) 5.1.5.4.1　人工定性檢測(cè)：將光電檢測(cè)管放入36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12-24h。 5.1.5.4.2　自動(dòng)定性檢測(cè)：將光電檢測(cè)管放入光電檢測(cè)儀中，并設(shè)置程序后開(kāi)始檢測(cè)：菌落總數(shù)，24 h。 5.1.5.4.3　定量檢測(cè)：將光電檢測(cè)管放入光電檢測(cè)儀中，選擇菌落總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，設(shè)置程序后開(kāi)始檢測(cè)：菌落總數(shù)，24 h。 結(jié)果判定及表述 5.1.5.5.1　人工定性檢測(cè)：培養(yǎng)至12h-24h時(shí)觀察光電檢測(cè)管中是否產(chǎn)生顏色變化。與空白對(duì)照相比，若檢測(cè)管明顯渾濁或變黃即視為菌落總數(shù)陽(yáng)性，即“每1 mL水中檢出菌落總數(shù)”；若檢測(cè)管未產(chǎn)生渾濁或變黃即視為菌落總數(shù)陰性，即“每1 mL水中未檢出菌落總數(shù)”。 5.1.5.5.2　自動(dòng)定性檢測(cè)：程序運(yùn)行結(jié)束后會(huì)自動(dòng)生成檢測(cè)報(bào)告。若檢測(cè)報(bào)告顯示菌落總數(shù) >1 CFU/mL即視為菌落總數(shù)陽(yáng)性，即“每1 mL水中檢出菌落總數(shù)”；若檢測(cè)報(bào)告顯示菌落總數(shù) <1 CFU/mL即視為菌落總數(shù)陰性，即“每1 mL水中未檢出菌落總數(shù)”。 5.1.5.5.3　定量檢測(cè)：程序運(yùn)行結(jié)束后自動(dòng)生成檢測(cè)報(bào)告。若菌落總數(shù)為陽(yáng)性，則會(huì)在檢測(cè)報(bào)告上顯示菌落總數(shù)的具體數(shù)值；若菌落總數(shù)為陰性，則會(huì)在檢測(cè)報(bào)告顯示菌落總數(shù) <1 CFU/mL。 大腸菌群測(cè)定 5.2.1　原理 在37℃下培養(yǎng)24h，大腸菌群能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶( β-D-galactosidase )，將大腸菌群檢測(cè)試劑中的鄰硝基苯β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）分解為黃色的鄰硝基苯酚（ONP），該顏色變化可以被肉眼捕捉，也可以被光電檢測(cè)儀的信號(hào)源捕捉，進(jìn)而完成測(cè)定。 5.2.2　儀器和設(shè)備 冰箱:2 ℃～5 ℃。 渦旋振蕩器。 無(wú)菌吸管:1 mL(具0.01 mL 刻度)、5 mL(具0.1 mL 刻度)或微量移液器及吸頭。 恒溫培養(yǎng)箱:36 ℃±1 ℃。 微生物光電檢測(cè)系統(tǒng)（如FORBID-M光電檢測(cè)儀）。 光電檢測(cè)管（如FORBID-M光電檢測(cè)管）。 六聯(lián)過(guò)濾器。 氣液兩用真空泵。 5.2.3　 培養(yǎng)基和試劑  大腸菌群快速檢測(cè)試劑：見(jiàn)附錄 2.2。 大腸菌群質(zhì)控菌株：大腸埃希氏菌 CICC 10389、陰溝腸桿菌 ATCC 13047、弗氏檸檬酸桿菌 ATCC 43864。  5.2.4　檢驗(yàn)程序  大腸菌群的檢驗(yàn)程序見(jiàn)圖2。 圖 2 大腸菌群檢驗(yàn)程序 5.2.5　操作步驟  培養(yǎng)基準(zhǔn)備 使用一次性無(wú)菌吸管或微量移液器及吸頭吸取大腸菌群快速檢測(cè)試劑加入光電檢測(cè)管中，5 mL/管。 樣品的接種  在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行過(guò)濾操作。首先用無(wú)菌鑷子夾取滅菌濾膜邊緣部分，將粗糙面向上，貼放在已滅菌的濾床上，固定好濾器，將100mL水樣通過(guò)孔徑0.45μm的濾膜過(guò)濾。 將過(guò)濾后的濾膜（折疊）放入已加好大腸菌群快速檢測(cè)試劑的光電檢測(cè)管中并做好標(biāo)記。其中1支檢測(cè)管不加檢測(cè)樣品作為空白對(duì)照。 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 5.2.5.3.1　如需定量時(shí)，以滅菌處理后的無(wú)菌樣品做為稀釋基質(zhì)，使用渦旋振蕩器對(duì)大腸菌群質(zhì)控菌株進(jìn)行十倍梯度稀釋，選擇5-7個(gè)適宜的稀釋梯度，按照5.2.5.1-5.2.5.4中的操作步驟使用微生物光電檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)使用無(wú)選擇性的LB平板培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)。 5.2.5.3.2　得出結(jié)果后，以儀器擬合拐點(diǎn)時(shí)間（h）為橫坐標(biāo)，平板計(jì)數(shù)結(jié)果對(duì)數(shù)值（log C）為縱坐標(biāo)建立線性相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)曲線，若線性相關(guān)系數(shù)滿足 R2 ≥ 0.98 時(shí)，即可將命名為大腸菌群的標(biāo)準(zhǔn)曲線寫入儀器，反之則需重新建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。 5.2.5.3.3　若無(wú)需對(duì)結(jié)果定量時(shí)，則直接跳過(guò)5.2.5.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立步驟。 培養(yǎng) 5.2.5.4.1　人工定性檢測(cè)：將光電檢測(cè)管放入36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12-24h。 5.2.5.4.2　自動(dòng)定性檢測(cè)：將光電檢測(cè)管放入光電檢測(cè)儀中，并設(shè)置程序后開(kāi)始檢測(cè)：大腸菌群，24 h。 5.2.5.4.3　定量檢測(cè)：將光電檢測(cè)管放入光電檢測(cè)儀中，選擇大腸菌群標(biāo)準(zhǔn)曲線，設(shè)置程序后開(kāi)始檢測(cè)：大腸菌群，24h。 結(jié)果判定及表述 5.2.5.5.1　人工定性檢測(cè)：培養(yǎng)至12h-24h時(shí)觀察光電檢測(cè)管中是否產(chǎn)生顏色變化。與空白對(duì)照相比，若檢測(cè)管明顯渾濁或變黃即視為大腸菌群陽(yáng)性，即“每1 mL水中檢出大腸菌群”；若檢測(cè)管未產(chǎn)生渾濁或變黃即視為大腸菌群陰性，即“每1 mL水中未檢出大腸菌群”。 5.2.5.5.2　自動(dòng)定性檢測(cè)：程序運(yùn)行結(jié)束后會(huì)自動(dòng)生成檢測(cè)報(bào)告。若檢測(cè)報(bào)告顯示大腸菌群 >1 CFU/mL即視為大腸菌群陽(yáng)性，即“每1 mL水中檢出大腸菌群”；若檢測(cè)報(bào)告顯示大腸菌群 <1 CFU/mL即視為大腸菌群陰性，即“每1 mL水中未檢出大腸菌群”。 5.2.5.5.3　定量檢測(cè)：程序運(yùn)行結(jié)束后自動(dòng)生成檢測(cè)報(bào)告。若大腸菌群為陽(yáng)性，則會(huì)在檢測(cè)報(bào)告上顯示大腸菌群的具體數(shù)值；若大腸菌群為陰性，則會(huì)在檢測(cè)報(bào)告顯示大腸菌群 <1 CFU/mL。 大腸埃希氏菌測(cè)定 5.3.1　原理  在37℃培養(yǎng)24h，大腸埃希氏菌能產(chǎn)生β-葡萄糖醛酸酶(β-Glucuronidase)，將大腸埃希氏菌快速檢測(cè)試劑中的4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)分解為4-甲基傘形酮，在365 nm紫外燈照射下產(chǎn)生藍(lán)白色熒光。 5.3.2　儀器和設(shè)備 冰箱:2℃～5℃。 渦旋振蕩器。 無(wú)菌吸管:1 mL(具0.01 mL 刻度)、5 mL(具0.1 mL 刻度)或微量移液器及吸頭。 恒溫培養(yǎng)箱:36℃±1℃。 微生物光電檢測(cè)系統(tǒng)（如FORBID-M光電檢測(cè)儀）。 光電檢測(cè)管（如FORBID-M光電檢測(cè)管）。 365 nm 紫外光源。  六聯(lián)過(guò)濾器。 氣液兩用真空泵。 5.3.3　培養(yǎng)基和試劑  大腸埃希氏菌快速檢測(cè)試劑:見(jiàn)附錄 2.3。 大腸埃希氏菌質(zhì)控菌株：大腸埃希氏菌 CICC 10389。 5.3.4　檢驗(yàn)程序  大腸埃希氏菌的檢驗(yàn)程序見(jiàn)圖3。 圖 3 大腸埃希氏菌檢驗(yàn)程序 5.3.5　操作步驟  培養(yǎng)基準(zhǔn)備 使用一次性無(wú)菌吸管或微量移液器及吸頭吸取大腸埃希氏菌快速檢測(cè)試劑加入光電檢測(cè)管中，5 mL/管。 樣品的接種 在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行過(guò)濾操作。首先用無(wú)菌鑷子夾取滅菌濾膜邊緣部分,將粗糙面向上，貼放在已滅菌的濾床上，固定好濾器，將100mL水樣或稀釋液通過(guò)孔徑0.45μm的濾膜過(guò)濾。 將過(guò)濾后的濾膜（折疊）放入已加好大腸埃希氏菌快速檢測(cè)試劑的光電檢測(cè)管中并做好標(biāo)記。其中1支檢測(cè)管不加檢測(cè)樣品作為空白對(duì)照。 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 5.3.5.3.1　如需定量時(shí)，以滅菌處理后的無(wú)菌樣品做為稀釋基質(zhì)，使用渦旋振蕩器對(duì)大腸埃希氏菌質(zhì)控菌株進(jìn)行十倍梯度稀釋，選擇5-7個(gè)適宜的稀釋梯度，按照5.3.5.1-5.3.5.4中的操作步驟使用微生物光電檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)使用無(wú)選擇性的LB平板培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)。 5.3.5.3.2　得出結(jié)果后，以儀器擬合拐點(diǎn)時(shí)間（h）為橫坐標(biāo)，平板計(jì)數(shù)結(jié)果對(duì)數(shù)值（log C）為縱坐標(biāo)建立線性相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)曲線，若線性相關(guān)系數(shù)滿足 R2 ≥ 0.98 時(shí)，即可將命名為大腸埃希氏菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線寫入儀器，反之則需重新建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。 5.3.5.3.3　若無(wú)需對(duì)結(jié)果定量時(shí)，則直接跳過(guò)5.3.5.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立步驟。 培養(yǎng) 5.3.5.4.1　人工定性檢測(cè)：將光電檢測(cè)管放入36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12-24h。 5.3.5.4.2　自動(dòng)定性檢測(cè)：將光電檢測(cè)管放入光電檢測(cè)儀中，并設(shè)置程序后開(kāi)始檢測(cè)：大腸埃希氏菌，24 h。 5.3.5.4.3　定量檢測(cè)：將光電檢測(cè)管放入光電檢測(cè)儀中，選擇大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)曲線，設(shè)置程序后開(kāi)始檢測(cè)：大腸埃希氏菌，24 h。 結(jié)果判定及表述 5.3.5.5.1　人工定性檢測(cè)：培養(yǎng)至12h-24h時(shí)使用365 nm紫外光源觀察光電檢測(cè)管中是否有藍(lán)白色熒光產(chǎn)生。與空白對(duì)照相比，若被檢樣品產(chǎn)生明顯的藍(lán)白色熒光即視為大腸埃希氏菌陽(yáng)性，即“每100mL水中檢出大腸埃希氏菌”；若被檢樣品未產(chǎn)生藍(lán)白色熒光即視為大腸埃希氏菌陰性，即“每100 mL水中未檢出大腸埃希氏菌”。 5.3.5.5.2　自動(dòng)定性檢測(cè)：程序運(yùn)行結(jié)束后會(huì)自動(dòng)生成檢測(cè)報(bào)告。若檢測(cè)報(bào)告顯示大腸埃希氏菌 >1 CFU/100mL即視為大腸埃希氏菌陽(yáng)性，即“每100 mL水中檢出大腸埃希氏菌”；若檢測(cè)報(bào)告顯示大腸埃希氏菌 <1 CFU/100mL即視為大腸埃希氏菌陰性，即“每100 mL水中未檢出大腸埃希氏菌”。 5.3.5.5.3　定量檢測(cè)：程序運(yùn)行結(jié)束后自動(dòng)生成檢測(cè)報(bào)告。若大腸埃希氏菌為陽(yáng)性，則會(huì)在檢測(cè)報(bào)告上顯示大腸埃希氏菌的具體數(shù)值；若大腸埃希氏菌為陰性，則會(huì)在檢測(cè)報(bào)告顯示大腸埃希氏菌 <1 CFU/100mL。 銅綠假單胞菌測(cè)定 5.4.1　原理 在37℃下培養(yǎng)30h，銅綠假單胞菌能產(chǎn)生β-丙氨酰氨肽酶，將選擇性培養(yǎng)基中的探針L-丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素三氟乙酸鹽（H-Ala-AMC-TFA）分解為4-甲基傘形酮，在365 nm紫外燈照射下產(chǎn)生熒光。 5.4.2　儀器和設(shè)備 冰箱:2 ℃～5 ℃。 渦旋振蕩器。 無(wú)菌吸管:1 mL(具0.01 mL 刻度)、5 mL(具0.1 mL 刻度)或微量移液器及吸頭。 恒溫培養(yǎng)箱:36 ℃±1 ℃。 微生物光電檢測(cè)系統(tǒng)（如FORBID-M光電檢測(cè)儀）。 光電檢測(cè)管（如FORBID-M光電檢測(cè)管）。 365 nm 紫外光源。  氣液兩用真空泵。 5.4.3　培養(yǎng)基和試劑  銅綠假單胞菌快速檢測(cè)試劑:見(jiàn)附錄 2.4。 銅綠假單胞菌質(zhì)控菌株：銅綠假單胞菌 ATCC 9027。 5.4.4　檢驗(yàn)程序  銅綠假單胞菌的檢驗(yàn)程序見(jiàn)圖4。 圖 4 銅綠假單胞菌檢驗(yàn)程序 5.4.5　操作步驟  培養(yǎng)基準(zhǔn)備 使用一次性無(wú)菌吸管或微量移液器及吸頭吸取銅綠假單胞菌快速檢測(cè)試劑加入光電檢測(cè)管中，5 mL/管。 樣品的接種 在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行過(guò)濾操作。首先用無(wú)菌鑷子夾取滅菌濾膜邊緣部分，將粗糙面向上，貼放在已滅菌的濾床上，固定好濾器，將250mL水樣或稀釋液通過(guò)孔徑0.45μm的濾膜過(guò)濾。 將過(guò)濾后的濾膜（折疊）放入已加好銅綠假單胞菌快速檢測(cè)試劑的光電檢測(cè)管中并做好標(biāo)記。其中1支檢測(cè)管不加檢測(cè)樣品作為空白對(duì)照。 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 5.4.5.3.1　如需定量時(shí)，以滅菌處理后的無(wú)菌樣品做為稀釋基質(zhì)，使用渦旋振蕩器對(duì)銅綠假單胞菌質(zhì)控菌株進(jìn)行十倍梯度稀釋，選擇5-7個(gè)適宜的稀釋梯度，按照5.4.5.1-5.4.5.4中的操作步驟使用光電檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)使用無(wú)選擇性的LB平板培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)。 5.4.5.3.2　得出結(jié)果后，以儀器擬合拐點(diǎn)時(shí)間（h）為橫坐標(biāo)，平板計(jì)數(shù)結(jié)果對(duì)數(shù)值（log C）為縱坐標(biāo)建立線性相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)曲線，若線性相關(guān)系數(shù)滿足 R2 ≥ 0.98 時(shí)，即可將命名為銅綠假單胞菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線寫入儀器，反之則需重新建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。 5.4.5.3.3　若無(wú)需對(duì)結(jié)果定量時(shí)，則直接跳過(guò)5.4.5.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立步驟。 培養(yǎng) 5.4.5.4.1　人工定性檢測(cè)：將光電檢測(cè)管放入36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)17-30h。 5.4.5.4.2　自動(dòng)定性檢測(cè)：將光電檢測(cè)管放入光電檢測(cè)儀中，并設(shè)置程序：銅綠假單胞菌，30h。 5.4.5.4.3　定量檢測(cè)：將光電檢測(cè)管放入光電檢測(cè)儀中，選擇銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)曲線，設(shè)置程序后開(kāi)始檢測(cè)：銅綠假單胞菌，30h。 結(jié)果判定及表述 5.4.5.5.1　人工定性檢測(cè)：培養(yǎng)至17h-30h時(shí)使用365 nm紫外光源觀察光電檢測(cè)管中是否有藍(lán)白色熒光產(chǎn)生。與空白對(duì)照相比，若被檢樣品產(chǎn)生明顯的藍(lán)白色熒光即視為銅綠假單胞菌陽(yáng)性，即“每250mL水中檢出銅綠假單胞菌”；若被檢樣品測(cè)試孔未產(chǎn)生藍(lán)白色熒光即視為銅綠假單胞菌陰性，即“每250mL水中未檢出銅綠假單胞菌”。 5.4.5.5.2　自動(dòng)定性檢測(cè)：程序運(yùn)行結(jié)束后會(huì)自動(dòng)生成檢測(cè)報(bào)告。若檢測(cè)報(bào)告顯示銅綠假單胞菌 >1 CFU/250mL即視為銅綠假單胞菌陽(yáng)性，即“每250mL水中檢出銅綠假單胞菌”；若檢測(cè)報(bào)告顯示銅綠假單胞菌 <1 CFU/250mL即視為銅綠假單胞菌陰性，即“每250mL水中未檢出銅綠假單胞菌”。 5.4.5.5.3　定量檢測(cè)：程序運(yùn)行結(jié)束后會(huì)自動(dòng)生成檢測(cè)報(bào)告。若銅綠假單胞菌為陽(yáng)性，則會(huì)在檢測(cè)報(bào)告上顯示銅綠假單胞菌的具體數(shù)值；若銅綠假單胞菌為陰性，則會(huì)在檢測(cè)報(bào)告顯示銅綠假單胞菌 <1 CFU/250mL。

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