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基于TCGA大數(shù)據(jù)，分析驗證未在所研究腫瘤中被報道過功能或臨床相關(guān)性的新lncRNA功能基因，探討其致病的分子機制，為后續(xù)抗腫瘤藥物的靶點以及生物標(biāo)記物的確定提供前期數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

技術(shù)原理

長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA, lncRNA)是長度大于 200 個核苷酸的非編碼 RNA。越來越多的研究表明lncRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用。通過TCGA大數(shù)據(jù)，分析出與生存期相關(guān)的lncRNA，通過吉凱基因疾病關(guān)鍵基因?qū)＠麛?shù)據(jù)庫，分析出在所研究腫瘤中沒有報道過的候選lncRNA，利用慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)，對若干個候選lncRNA分別進行RNAi，通過Cellomics高內(nèi)涵功能篩選（HCS）平臺（超鏈接至HCS界面）對感染后的細(xì)胞進行4～5天細(xì)胞計數(shù)，尋找到對細(xì)胞增殖有影響的目的lncRNA，通過FISH實驗確定目的lncRNA的細(xì)胞內(nèi)定位。并獲得該lncRNA在兩株細(xì)胞上的至少3個增殖方向功能學(xué)實驗（MTT/細(xì)胞周期（PI/流式法）/凋亡（Annexin V/流式法）/BrdU/克隆形成等）以及2個轉(zhuǎn)移方向功能學(xué)實驗（劃痕愈合/Transwell遷移/Transwell侵襲等）陽性結(jié)果。在動物水平研究中，進行裸鼠皮下成瘤或者尾靜脈注射成瘤模型檢測目的lncRNA的體內(nèi)功能。在機制研究部分，構(gòu)建目的lncRNA過表達以及對照穩(wěn)定株，用生物素標(biāo)記目的lncRNA后進行RNA-pulldown，跑膠切割差異條帶進行LC-MS/MS測試分析，分析篩選目的lncRNA的互作蛋白，運用RIP實驗驗證互作蛋白與lncRNA的結(jié)合。對篩選到的陽性互作蛋白，構(gòu)建干擾或過表達載體，在一株細(xì)胞株中干擾目的lncRNA的同時干擾或過表達陽性互作蛋白，通過HCS連續(xù)5天掃版觀察細(xì)胞增殖能力的變化，驗證下游機制基因?qū)δ康膌ncRNA的功能回復(fù)作用，并獲得一個增殖相關(guān)和一個轉(zhuǎn)移相關(guān)功能學(xué)實驗的陽性回復(fù)實驗結(jié)果。

結(jié)果展示

1. 初步篩選目的功能lncRNA：通過TCGA大數(shù)據(jù)，分析出與生存期相關(guān)的lncRNA，將候選lncRNA shRNA慢病毒感染靶細(xì)胞，使靶細(xì)胞內(nèi)源表達的候選lncRNA表達下調(diào)，通過Cellomics高內(nèi)涵功能篩選（HCS）平臺（超鏈接至HCS界面）對感染后的細(xì)胞進行4～5天細(xì)胞計數(shù)，觀察候選lncRNA表達下調(diào)后的細(xì)胞與對照細(xì)胞相比細(xì)胞增殖（或劃痕愈合）的變化，從而推斷對細(xì)胞增殖（轉(zhuǎn)移）有影響的lncRNA。

注：最后提供一個陽性lncRNA@一株細(xì)胞的數(shù)據(jù)，含Negative Control（NC）和目的lncRNA RNAi兩組結(jié)果。陰性基因數(shù)據(jù)不提供。

示例圖：

2. 目的lncRNA細(xì)胞功能驗證：用shRNA慢病毒在靶細(xì)胞中沉默目的lncRNA，qPCR驗證目的基因在細(xì)胞中的敲減效率，用目的lncRNA探針FISH驗證目的基因胞內(nèi)定位，并在兩株細(xì)胞上進行MTT/細(xì)胞周期（PI/流式法）/凋亡（Annexin V/流式法）/BrdU/克隆形成等增殖方向的功能學(xué)實驗以及轉(zhuǎn)移方向功能學(xué)實驗（劃痕愈合/Transwell遷移/Transwell侵襲等）。分組：NC vs KD，每組三個復(fù)孔。承諾在兩株腫瘤靶細(xì)胞中該lncRNA敲減后的至少3個增殖方向（含HCS增殖檢測）的功能學(xué)陽性實驗結(jié)果或者2個轉(zhuǎn)移方向（含HCS轉(zhuǎn)移檢測）的功能學(xué)陽性結(jié)果。

示例圖—增殖方向?qū)嶒灒?/p>

示例圖—轉(zhuǎn)移方向?qū)嶒灒?/p>

3. 目的lncRNA體內(nèi)功能驗證：制備目的lncRNA敲低實驗組或?qū)φ战M成瘤細(xì)胞，注射裸鼠皮下或者尾靜脈，構(gòu)建裸鼠皮下成瘤模型或者尾靜脈腫瘤轉(zhuǎn)移模型，飼養(yǎng)裸鼠至瘤體長成，記錄動物體重，瘤體大小曲線或進行活體成像，處死后收集瘤體稱重，處理數(shù)據(jù)結(jié)果。

示例圖：

4. lncRNA作用機制研究：構(gòu)建lncRNA過表達載體以及對照載體；制備慢病毒，感染細(xì)胞，構(gòu)建lncRNA過表達穩(wěn)定株以及對照細(xì)胞株，qPCR檢測過表達水平；用生物標(biāo)記目的lncRNA，并進行RNA pull-down，切割目的組和對照組的差異條帶，酶解提取肽段。將肽段樣品分別進行LC-MS/MS測試分析，通過數(shù)據(jù)庫檢索完成蛋白的鑒定，并分析篩選候選互作蛋白。用候選互作基因抗體進行RIP驗證目的lncRNA與互作蛋白的結(jié)合。

示例圖：

5. 根據(jù)實驗4中RNA pull-down和RIP結(jié)果選擇一個陽性互作蛋白，構(gòu)建攜帶紅色熒光的干擾或過表達載體，在一株細(xì)胞株中干擾目的lncRNA（感染攜帶綠色熒光的干擾慢病毒）的同時干擾或過表達陽性互作蛋白（感染攜帶紅色熒光的干擾或過表達慢病毒），通過HCS連續(xù)5天掃版觀察黃色熒光細(xì)胞增殖能力的變化，驗證下游機制基因?qū)δ康膌ncRNA的功能回復(fù)作用，并獲得一個增殖相關(guān)和一個轉(zhuǎn)移相關(guān)功能學(xué)實驗的陽性回復(fù)實驗結(jié)果，實驗分組：NC（目的lncRNA）+NC（下游機制基因）；KD（目的lncRNA）+NC（下游機制基因）；KD（目的lncRNA）+OE/KD（下游機制基因）。

研究技術(shù)路線

參考文獻

1.Wang et al. Long noncoding RNA EGFR-AS1 promotes cell growth and metastasis via affecting HuR mediated mRNA stability of EGFR in renal cancer. Cell Death Dis. 2019;10(3):154.

2.et al. The long non-coding RNA Linc-GALH promotes hepatocellular carcinoma metastasis via epigenetically regulating Gankyrin. Cell Death Dis. 2019;10(2):86.

3.Li et al. X chromosome-linked long noncoding RNAlnc-XLEC1 regulates c-Myc-dependent cell growth by collaborating with MBP-1 in endometrial cancer. Int J Cancer. 2019;doi: 10.1002.

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