干細(xì)胞“飛”凡解讀之iPSC三胚層分化能力篇

賽默飛生命科學(xué)

2023.8.23

自從2012諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)?lì)C發(fā)給“體細(xì)胞重編程”技術(shù)以后，干細(xì)胞領(lǐng)域的研究直接被按下了“加速鍵”。賽默飛作為干細(xì)胞研究的支持者，希望幫助大家從不同的細(xì)分方向中獲得新的啟發(fā)，特別推出賽默飛干細(xì)胞“飛”凡解讀活動(dòng)，本期將探討iPSC三胚層的分化能力。

iPSC在多種細(xì)胞因子相互作用下，可分化形成內(nèi)、中、外3個(gè)胚層。進(jìn)而可以體外模擬人胚發(fā)育，構(gòu)建模擬標(biāo)準(zhǔn)化的人體細(xì)胞、組織和器官。下面，我們就從近年發(fā)布的高分文章中對(duì)于“iPSC三胚層的分化能力”一窺究竟！

內(nèi)胚層

糖尿病是一種嚴(yán)重威脅患者健康的慢性疾病，一直缺乏有效的治愈手段。而干細(xì)胞治療則被認(rèn)為在治療1型糖尿病中具有極大地應(yīng)用前景。近年關(guān)于使用iPSC衍生的功能性β細(xì)胞研究取得了顯著的進(jìn)展。其基本策略是重演了胚胎時(shí)期多能干細(xì)胞分化的主要路徑：形成明確的內(nèi)胚層，然后胰腺內(nèi)胚層，再到內(nèi)分泌前體細(xì)胞（祖細(xì)胞）并最終形成胰島細(xì)胞?。

而如何精準(zhǔn)誘導(dǎo)iPSC向內(nèi)胚層分化是其中至關(guān)重要的一步。

在一項(xiàng)iPSC衍生的胰腺祖細(xì)胞研究中，作者從文獻(xiàn)中選擇了5種方法在Essential 8 培養(yǎng)基或KSR/MEF培養(yǎng)基中誘導(dǎo)PSC定向分化為內(nèi)胚層，并進(jìn)一步采用6種方案評(píng)估其分化為胰腺祖細(xì)胞的能力。為了評(píng)估體外內(nèi)胚層定向分化的能力。研究人員使用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)CD117 和 CXCR4這兩個(gè)內(nèi)胚層分化表面標(biāo)志物進(jìn)行了檢測(cè)。同時(shí)，作者對(duì)比了KSR/MEF 和E8培養(yǎng)基在分化效率的區(qū)別。結(jié)果表明在DE4和DE5的培養(yǎng)方案下KSR/MEF培養(yǎng)效果較差，細(xì)胞幾乎完全死亡。而在DE1-3方案中，兩者效果相近。這表明不同的培養(yǎng)基條件，對(duì)于干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化具有重要影響，尤其是在內(nèi)胚層這樣的關(guān)鍵分化步驟中。

Fig.1 PSC differentiation to definitive endoderm

進(jìn)一步地，研究人員又比較了KSR/MEF 或 E8 培養(yǎng)基中 PSC 從?內(nèi)胚層?分化到表達(dá)PDX1細(xì)胞的能力（PDX1 控制胰腺的胚胎期發(fā)育，存在于正常成熟胰腺的β細(xì)胞中）。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表明使用方案5和6中E8培養(yǎng)基誘導(dǎo)細(xì)胞分化的效率更高。而KSR/MEF培養(yǎng)基在各個(gè)方案中變異系數(shù)較大。因此為了保持研究結(jié)果的穩(wěn)定性，研究人員僅采用了E8培養(yǎng)基用于后續(xù)的研究。

Fig.2 Differentiation from DE to PDX1+ presumptive pancreatic endoderm.

中胚層

心臟病可能是我們?nèi)粘Ｂ?tīng)過(guò)最多的醫(yī)學(xué)名詞之一。心臟作為第一個(gè)在發(fā)育過(guò)程中形成的功能性器官，也是最難在體外建立模型的器官之一。目前通過(guò)一些動(dòng)物以及干細(xì)胞模型的研究工作，科學(xué)家們對(duì)于心臟譜系在胚胎中胚層中的命運(yùn)決定方式已經(jīng)有了一定認(rèn)識(shí)，主要包括心肌細(xì)胞（Cardiomyocytes，CMs）、心內(nèi)膜細(xì)胞（Endocardial cells， ECs）以及心外膜細(xì)胞（Epicardial cells）。

Nature Biotechnology在2021年發(fā)表了一篇題為《Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development》的研究性文章。在文中，研究人員構(gòu)建了一個(gè)高度結(jié)構(gòu)化的復(fù)雜三維心臟形成類(lèi)器官?(HFO)，為研究早期心臟發(fā)育提供了新的研究方案。

近年來(lái)關(guān)于使用干細(xì)胞構(gòu)建心臟類(lèi)器官的研究曾出不窮，然而這些研究并未涉及早期心臟發(fā)育的時(shí)空模式，包括與前腸內(nèi)胚層的相互作用。在這篇研究中，研究人員首先將人PSC預(yù)鋪在Geltrex包被板上，然后在形成 HFO 之前轉(zhuǎn)移至E8培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。通過(guò)14天培養(yǎng)，研究人員獲得了直徑約 2 mm 的類(lèi)器官。隨后，通過(guò)對(duì)HFO進(jìn)行熒光顯微鏡和激光掃描光學(xué)斷層成像，研究人員確定了HFO的徑向?qū)ΨQ(chēng)性生長(zhǎng)特性，進(jìn)一步地免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)了HFO的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：被密集的心肌層包圍?，并被松散排列的心肌細(xì)胞和橫隔樣細(xì)胞覆蓋，最終被間充質(zhì)細(xì)胞包圍。

Fig.3 HFOs recapitulate pns of early cardiomyogenesis.

此外，研究人員又使用CD31 染色對(duì)HFO內(nèi)血管樣結(jié)構(gòu)和心內(nèi)膜樣細(xì)胞的形成過(guò)程進(jìn)行了鑒定。透射電鏡進(jìn)一步確定了HFO 內(nèi)血管的結(jié)構(gòu)形成特征。隨后，研究人員又通過(guò)組織學(xué)方法對(duì)HFO內(nèi)SOX17、SOX2 和 HNF4α 的差異表達(dá)進(jìn)行了分析，揭示了不同的前腸內(nèi)胚層組織分化；同時(shí)使用scRNA-seq對(duì)不同時(shí)期的前后內(nèi)胚層表達(dá)模式進(jìn)行了分析。最后，體外測(cè)試了 HFO 對(duì)NKX2.5 -KO 表型建模方面的適用性。

外胚層

隨著神經(jīng)退行性疾病的日益增多，臨床上目前仍然缺乏療效確切的治療藥物，以致神經(jīng)退行性疾病至今仍無(wú)法達(dá)到令人滿(mǎn)意的治療效果。而干細(xì)胞療法則為神經(jīng)退行性疾病的治療提供了新途徑。

在?Nature Genetics?的一篇文章《Molecular and functional variation in iPSC-derived sensory neurons》中，研究人員比較了飼養(yǎng)層系統(tǒng)培養(yǎng)的iPSC (feeder iPSCs)和無(wú)飼養(yǎng)層系統(tǒng)培養(yǎng)的iPSC (E8 iPSCs)在基因表達(dá)圖譜上的巨大差異。

Fig.4 Gene expression variability in IPSDSNs is influenced by differentiation conditions.

Fig.5 Characterization of molecular phenotypes in iPSC-derived sensory neurons.

在這項(xiàng)研究中，研究人員使用107個(gè)來(lái)自無(wú)關(guān)的、明顯健康的個(gè)體的iPSC 譜系進(jìn)行了123次分化，在經(jīng)過(guò)質(zhì)控后，研究人員獲得了119個(gè)iPSC的差異表達(dá)樣本，并對(duì)其中106個(gè)P2樣本進(jìn)行了分析（QTL除外）。

Fig.6? A heat map of RNA-seq data for ten marker genes of the two cell clusters identified by SC3

隨后，為了減少研究誤差，研究人員又使用scRNA-seq對(duì)來(lái)自同一個(gè)體的 177 個(gè) IPSDSN 進(jìn)行了測(cè)序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)IPSDSN與DRG在全基因組表達(dá)方面具有較大的相似性。

由于使用iPSC 開(kāi)展遺傳研究的一個(gè)核心問(wèn)題是細(xì)胞表型的異質(zhì)性。這種異質(zhì)性可能源于供體遺傳背景、克隆選擇的影響以及重編程和分化過(guò)程中細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的影響。因此，研究人員又對(duì)IPSDSN基因表達(dá)的異質(zhì)性進(jìn)行了分析，結(jié)果表明IPSSSNs 中神經(jīng)元基因的表達(dá)存在較大異質(zhì)性，這可能是分化變異的結(jié)果。

為了進(jìn)一步探究異質(zhì)性存在的原因，研究人員對(duì)iPSC培養(yǎng)條件進(jìn)行了比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞受分化前的iPSC培養(yǎng)條件的影響。在E8培養(yǎng)基中 iPSCs 分化出的神經(jīng)元含量更高。同時(shí)，研究人員使用RASQUAL和ATAC-seq等方法還發(fā)現(xiàn)遺傳變異還能夠影響感覺(jué)神經(jīng)元的基因表達(dá)、剪接和染色質(zhì)可及性。

綜上，這項(xiàng)研究讓我們看到了iPSC分化神經(jīng)元在不同培養(yǎng)基中基因表達(dá)差異的巨大變化，尤其是與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)的基因，為我們開(kāi)展相關(guān)研究提供了一個(gè)參考。

總結(jié)

干細(xì)胞之所以被稱(chēng)為“萬(wàn)能細(xì)胞”，這依賴(lài)于干細(xì)胞的多向分化機(jī)制，干細(xì)胞擁有分化成為任何一個(gè)細(xì)胞的能力，通過(guò)分化成不同的細(xì)胞，繼而可以組成各類(lèi)器官和組織。而干細(xì)胞的胚層分化能力則是多向分化機(jī)制的第一步。

賽默飛干細(xì)胞好物推薦

/?Gibco? Essential 8 培養(yǎng)基?/

成分確定且一致性高的iPSCs無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)基

成分確定，無(wú)外源成分，批間差異更小

在Gibco cGMP質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系下生產(chǎn)

支持50代以上的iPSC培養(yǎng)，并可維持iPSC向所有三個(gè)胚系譜系分化的能力

/?Gibco? PSC多巴胺能神經(jīng)元分化試劑盒?/

Gibco? PSC多巴胺能神經(jīng)元分化試劑盒可使多能干細(xì)胞（PSC）分化成中腦多巴胺能神經(jīng)元。

PSC多巴胺能神經(jīng)元分化試劑盒具有更強(qiáng)的靈活性、速度和可擴(kuò)展性，同時(shí)保持合適的生物相關(guān)性

/?Invitrogen? DiI-Ac-LDL熒光試劑?/

乙?；疞DL – Dil復(fù)合物，可用于內(nèi)皮細(xì)胞示蹤

LDL生產(chǎn)周期短、性能穩(wěn)定

現(xiàn)有飛享價(jià)（貨號(hào)L3484）

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參考文獻(xiàn)：

1. Rostovskaya.etal.."Towards consistent generation of pancreatic lineage progenitors from human pluripotent stem cells." Philosophical Transactions of the Royal Society B：Biological Sciences 370.1680（2015）：20140365.

2. Drakhlis.et al."Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development."Nature Biotechnology 39.6（2021）：737-746.

3. Oksanen.et al."PSEN1 mutant iPSC-derived model reveals severe astrocyte pathology in Alzheimer''s disease."Stem cell reports 9.6（2017）：1885-1897.

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