【知識(shí)分享】液相和液質(zhì)系統(tǒng)中的管路和接頭

納譜分析

2022.12.23

本文將詳細(xì)講解管路(材質(zhì))和接頭(類(lèi)型)的選擇以及安裝操作方法，這不僅利于死體積的控制，還能夠有效改善目標(biāo)物的色譜行為。

管路的材質(zhì)

分析型液相色譜系統(tǒng)中，泵后輸液管路接口的外徑一般為1/16英寸(約1.6 mm)，而接頭的內(nèi)徑也是如此，僅有個(gè)別例外，比如某些閥和流通池。最被廣泛應(yīng)用的管路材料有不銹鋼、PEEK(聚醚醚酮)、PTFE(聚四氟乙烯)，以及其他一些特殊情形下使用的材料：鈦金屬、不銹鋼包覆的PEEK、PEEK包覆的熔融石英等。表1中列舉了這些材料的主要物化特性。

圖1A?不銹鋼管路

圖1B PEEK管路

表1?

HPLC常用材料的特點(diǎn)

材料

pH范圍

耐壓Mpa

優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)適用

不銹鋼

（SS）

1-14

130

耐壓高；

對(duì)弱極性/非極性溶劑耐受性好

不耐受鹵素離子；

不耐受強(qiáng)酸強(qiáng)堿；

存在游離金屬離子及離子型吸附位點(diǎn)，會(huì)對(duì)極少數(shù)強(qiáng)解離性目標(biāo)物(比如蛋白)的色譜行為產(chǎn)生負(fù)面影響。

滿(mǎn)足絕大多數(shù)液相色譜法應(yīng)用；

采用弱極性或非極性流動(dòng)相的正相色譜法的首選；

凝膠滲透色譜法的首選；

反相色譜法/反相離子對(duì)色譜法的極佳選擇，尤其是UHPLC

PEEK

0-14

對(duì)強(qiáng)酸強(qiáng)堿以及其他強(qiáng)極性溶液耐受性好；

不存在針對(duì)中強(qiáng)極性以及解離型目標(biāo)物的活性位點(diǎn)

耐壓性較差，在UHPLC中只能用在柱后。

對(duì)弱極性和非極性溶液耐受性差，如二氯甲烷、四氫呋喃、二甲基亞砜會(huì)使其溶脹。

滿(mǎn)足絕大多數(shù)液相色譜法應(yīng)用；

離子色譜的首選；

凝膠過(guò)濾色譜法的首選；

反相色譜法/反相離子對(duì)色譜法的極佳選擇，尤其適合強(qiáng)解離型目標(biāo)物

鈦

(Ti)

1-14

兼具不銹鋼與PEEK材質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)：對(duì)液相色譜法中涉及的溶液均能很好地耐受；對(duì)弱極性、中強(qiáng)極性以及解離型化合物均具有極好的惰性

昂貴

不銹鋼管線的極佳補(bǔ)充：對(duì)金屬敏感的蛋白質(zhì)和生物制劑的分析，通常溶劑條件都非常具有挑戰(zhàn)性。另外，生物分子易與表面發(fā)生非特異性結(jié)合。而鈦管線是這些應(yīng)用的首選。

不銹鋼包覆的PEEK

(內(nèi)層PEEK，外層不銹鋼)

1-14

由于是在PEEK管外壁包覆了不銹鋼材料，該管路耐壓可達(dá)600 Bar。因內(nèi)襯是PEEK材質(zhì)，故不含金屬，對(duì)生物樣品以及容易螯合金屬離子的小分子樣品友好

昂貴

與PEEK材質(zhì)適用范圍等同，但耐壓范圍極大擴(kuò)展，從耐壓角度看，能覆蓋大部分的UHPLC應(yīng)用。

PEEK?包覆熔融石英

0-10

最規(guī)則而光滑的內(nèi)壁，在所有類(lèi)型管線中能最好地抑制樣品擴(kuò)散，賦予最好的柱效；

管路內(nèi)徑最精準(zhǔn)；

耐受絕大多數(shù)有機(jī)試劑；

金屬雜質(zhì)含量極低，表面化學(xué)惰性好，與目標(biāo)物不存在特異吸附

pH范圍窄，不耐受較高pH的流動(dòng)相；

不耐受氫氟酸；

昂貴。

追求最高柱效的應(yīng)用。

PTFE

0-14

耐受強(qiáng)酸強(qiáng)堿；

幾乎不溶于任何有機(jī)試劑；

表面光滑

耐壓低；

易變形。

用做液相色譜系統(tǒng)的廢液管，如泵的purge管路以及檢測(cè)器的廢液管；用做柱后衍生的反應(yīng)管路

由于耐壓超高，不銹鋼材質(zhì)的管路是液相色譜系統(tǒng)的首選，也是UHPLC柱前管路的不二選擇。因不銹鋼對(duì)非極性、弱極性有機(jī)試劑的優(yōu)良耐受，也是正相色譜法和凝膠滲透色譜法(GPC)的首選。它自身的一個(gè)小缺陷就是可被鹵素離子（包括Cl-、Br-、I-）腐蝕，當(dāng)流路中存在不銹鋼材質(zhì)時(shí)，應(yīng)避免添加鹵素離子。此外，不銹鋼管路表面不可避免地存在金屬離子以及腐蝕后暴露的活性位點(diǎn)，會(huì)影響極少數(shù)解離型目標(biāo)物的色譜行為，譬如多羧基化合物螯合金屬離子后保留減弱導(dǎo)致峰前延、譬如目標(biāo)物的離子基團(tuán)在管路活性位點(diǎn)上吸附導(dǎo)致峰拖尾甚至分叉。假如同一條件下測(cè)試某解離型化合物，僅有部分液相色譜系統(tǒng)存在峰形異?，F(xiàn)象，不銹鋼管路值得被懷疑。這個(gè)問(wèn)題并非無(wú)解，采用EDTA-Na2水溶液沖洗系統(tǒng)可有效除去系統(tǒng)中游離的金屬離子。而采用5%~20%的硝酸水溶液沖洗系統(tǒng)既可以除去游離金屬離子又能鈍化管路(形成惰性的鉻氧化膜)。這兩種方法均能有效解決因不銹鋼管路導(dǎo)致的異常峰形。特別指出：能被不銹鋼管路影響的解離型化合物只是極少數(shù)。

因不存在極性吸附位點(diǎn)而且無(wú)金屬離子，PEEK管路是離子色譜和凝膠過(guò)濾色譜系統(tǒng)(GFC)的最佳選擇。而且由于PEEK對(duì)中強(qiáng)極性化合物、解離型化合物有優(yōu)異的惰性，在通用型色譜儀中分析解離型化合物時(shí)，它的表現(xiàn)(比如峰形)優(yōu)于不銹鋼管路。然而PEEK管路的耐壓較低，僅能確保20 MPa以?xún)?nèi)的壓力不漏液（雖然水作流動(dòng)相時(shí)可以耐受40 MPa）。使用5 μm甚至更粗粒徑填料時(shí)，PEEK管線可作為通用型色譜儀的良好選擇。當(dāng)更細(xì)粒徑的填料被使用時(shí)，由于色譜柱背壓高，PEEK管線僅能在柱后使用。此外，非極性和弱極性溶劑作流動(dòng)相的正相色譜以及凝膠滲透色譜不建議采用PEEK管線。

柱外效應(yīng)是影響柱效的重要因素，控制死體積范圍內(nèi)管路的內(nèi)徑和長(zhǎng)度可有效抑制柱外效應(yīng)，而選擇內(nèi)壁規(guī)則且平滑的管路則能更好地抑制樣品譜帶的層流和紊流，讓柱效進(jìn)一步提高，而且背壓更低。PEEK包覆熔融石英的管路是所有管路中規(guī)則最平滑的，專(zhuān)為追求超高柱效、高分離度的應(yīng)用設(shè)計(jì)。

接頭以及安裝方式

雖然市售的接頭種類(lèi)樣式繁多，然而大致可分為如下三類(lèi)：手?jǐn)Q式聚合物材質(zhì)接頭(2A)、不銹鋼接頭(2B)等。

△圖2A PEEK接頭

△圖2B?不銹鋼接頭

LC或LC-MS系統(tǒng)對(duì)接頭最基本的要求是，在工作壓力下能緊密地將管路與接口連接在一起。進(jìn)一步的要求則是，便于安裝和拆卸。圖3B是液相系統(tǒng)中接口（如色譜柱接口、雙通接口、閥接口以及其他能與管路相連的接口）的截面圖，灰色區(qū)域?yàn)楣腆w材料(通常為不銹鋼，個(gè)別情形為塑料材質(zhì))，淺綠色區(qū)域?yàn)榭紫?，用以容納接頭和管路，容納管路的區(qū)域內(nèi)徑為1/16英寸，長(zhǎng)度則因品牌而異。圖3A則是套在管路與接頭，接頭可以是圖2中的任意一種，韌環(huán)區(qū)域的內(nèi)徑為1/16英寸；管路可以是任意材質(zhì)，管路外徑為1/16英寸，管路恰好可以穿過(guò)接頭并伸出一部分長(zhǎng)度。

△圖3A?套在管路上的接頭

△圖3B?液相系統(tǒng)中接口的剖面圖

連接的一般方法是，將套有接頭的管路插到接口的底部，保證管路的切面緊貼接口底部。然后旋轉(zhuǎn)螺絲，讓螺絲和韌環(huán)向接口內(nèi)部靠近，當(dāng)韌環(huán)的外表面與接口中韌環(huán)區(qū)域的內(nèi)表面接觸，旋轉(zhuǎn)螺絲時(shí)的阻力開(kāi)始變大，適當(dāng)擰緊螺絲擠壓韌環(huán)(可借助工具)，一方面擠壓會(huì)使韌環(huán)外表面與接口韌環(huán)區(qū)域的內(nèi)表面緊密接觸，確保高壓流動(dòng)相下不發(fā)生泄露；另一方面韌環(huán)的尖端因擠壓而縮小，能夠緊緊地箍住管路，避免漏液并確保流動(dòng)相的高壓不會(huì)把管路從接頭中擠出，而始終與接口底部緊貼。由此可以看出，韌環(huán)是確保管路不移動(dòng)、流動(dòng)相不泄露的關(guān)鍵。

2.1

PEEK接頭

一直以來(lái)，PEEK接頭深受HPLC用戶(hù)喜愛(ài)，這主要是因?yàn)樗阌诎惭b與拆卸，而且它通常不會(huì)將管路抱死。在HPLC系統(tǒng)中，PEEK接頭一般只用在色譜柱入口及其后，可用于連接各種材質(zhì)的管路。圖4A-4D是PEEK接頭連接的詳細(xì)操作

△圖4A 將內(nèi)徑為1/16英寸的管路穿過(guò)PEEK接頭中間的孔，伸出長(zhǎng)度大約5-10 mm (因?yàn)椴煌放飘a(chǎn)品接口內(nèi)部用于容納管路的長(zhǎng)度有差異，所以此處伸出長(zhǎng)度最好長(zhǎng)一些)

△圖4B 將套有接頭的管路插入接口，并確保管路伸到接口底部，然后將接頭推向接口

△圖4C 旋轉(zhuǎn)PEEK接頭，假如連接的是雙通/色譜柱，也可以旋轉(zhuǎn)后者。擰緊接頭的過(guò)程中左手的其他三根手指夾住管路，使管路緊緊地頂住接口底部，避免產(chǎn)生死體積。假設(shè)接口是固定在儀器上的(比如流通池)，那么就可以左手捏住管路使其緊緊頂住接口底部，右手旋轉(zhuǎn)接頭。手?jǐn)Q接頭至管路無(wú)法轉(zhuǎn)動(dòng)。

△圖4D PEEK接頭與色譜柱擰緊后的狀態(tài)

當(dāng)PEEK接頭被使用，無(wú)論使用何種材質(zhì)的管路，接頭與管路均不會(huì)抱死，拆下接頭后，接頭能夠在管路上滑動(dòng)，連接不同深度的色譜柱接口時(shí)均能確保管路截面與色譜柱間沒(méi)有空隙。然而PEEK接頭耐壓能力不強(qiáng)，僅能保證20 MPa以?xún)?nèi)不漏液，超出這個(gè)壓力就得視操作者的手勁兒了。超壓的現(xiàn)象是，管路被高壓流動(dòng)相從接頭的韌環(huán)區(qū)域擠出，流動(dòng)相從接頭的孔中而非螺紋處滲出。

當(dāng)PEEK接頭與PEEK管路被使用，因二者均易于發(fā)生形變，擰緊接頭的過(guò)程中，接頭的韌環(huán)區(qū)域會(huì)因擠壓而縮小，繼而將韌環(huán)尖部套著的管路壓細(xì)，這種輕微的擠壓對(duì)于耐受更高的壓力是有好處的，拆卸后PEEK接頭仍能在管路上滑動(dòng)。然而多次安裝拆卸后，韌環(huán)和管路均明顯變細(xì)(如圖4E)，此時(shí)接頭很可能會(huì)抱死在管路上，既不能在管路上滑動(dòng)也不能旋轉(zhuǎn)。這雖然能稍稍增大PEEK接頭的耐壓，但管路從接頭上伸出的長(zhǎng)度就無(wú)法改變，無(wú)法適用于其他深度的色譜柱接口。此外，管路外徑變細(xì)后內(nèi)徑也相應(yīng)變細(xì)，更容易堵塞。綜合考量下，遇到此種情形，應(yīng)將管路變形的區(qū)域切掉并使用新接頭。PEEK接頭與不銹鋼材質(zhì)管路配合使用時(shí)，則基本不會(huì)發(fā)生形變，多次使用均能完好無(wú)損，然而耐壓甚至低于PEEK接頭+PEEK管路的組合。

△圖4E 多次使用后PEEK管路的形變

2.2

不銹鋼接頭

不銹鋼接頭與不銹鋼管路配合使用時(shí)，可以耐受不低于130 MPa的壓強(qiáng)，是液相色譜系統(tǒng)的極佳選擇。圖5A-5F是不銹鋼接頭與接口的連接方式。

△圖5A 一套不銹鋼接頭包含螺絲(左)、支撐環(huán)(支撐環(huán))、韌環(huán)。三者均能允許外徑為1/16英寸的管路穿過(guò)。

△圖5B 不銹鋼接頭在管路上的擺放順序。螺絲靠里、支撐環(huán)居中、韌環(huán)在外。

△圖5C 將套有接頭的管路插入接口，并確保管路伸到接口底部，然后將接頭推向接口。

△圖5D 手?jǐn)Q接頭，假如連接的是雙通/色譜柱，也可以旋轉(zhuǎn)后者。擰緊接頭的過(guò)程中左手的其他三根手指夾住管路，使管路緊緊地頂住接口底部，避免產(chǎn)生死體積。假設(shè)接口是固定在儀器上的（比如閥、柱溫箱熱交換器），那么就可以左手捏住管路使其緊緊頂住接口底部，右手旋轉(zhuǎn)接頭。??

△圖5E 手?jǐn)Q緊后，金屬接頭并不能牢固地抱住管路，還需扳手緊固。接頭一端使用1/4英寸扳手，接口一端視情況而定，如果接口一端是牢固不動(dòng)的則可以不用扳手。扳手?jǐn)Q緊的過(guò)程中，手指輕壓管路，確保管路接觸到接口底部。在手?jǐn)Q緊的狀態(tài)下，用扳手再擰約1/2圈即可（或者使用1.5 – 3 N*M的扭力扳手）。

△圖5F 將接頭從管路拆下來(lái)后可以發(fā)現(xiàn)，韌環(huán)在支撐環(huán)和接口的擠壓下已經(jīng)固定在管路上，而螺絲可以活動(dòng)，支撐環(huán)一般也是可以活動(dòng)的，假如支撐環(huán)緊貼韌環(huán)不可活動(dòng)，那么這次固定力氣或許過(guò)大了，如上圖。紅色箭頭區(qū)域?yàn)楣苈飞斐龅拈L(zhǎng)度，與接口內(nèi)部深度有關(guān)。韌環(huán)固定好以后，下次往接口連接時(shí)就不必?fù)?dān)心管路伸出長(zhǎng)度了，但一定要先手?jǐn)Q緊后再用扳手固定。

不銹鋼接頭+不銹鋼管路的組合因其無(wú)與倫比的耐壓性非常適合HPLC系統(tǒng)的柱前連接，比如泵-壓力傳感器-混合器-進(jìn)樣器-柱溫箱熱交換器之間，而且在這些區(qū)域安裝好以后基本不需要再次拆裝，不銹鋼接頭的不易操作性可以被忽略。與PEEK接頭相比，用這種接頭連接色譜柱則顯得不太便利。尤其需要注意的是，由于不同廠家的色譜柱接口深度不一樣，固定好的接頭不能同時(shí)滿(mǎn)足接口深度不同的兩款色譜柱。當(dāng)伸出的管路太長(zhǎng)（如圖6A），接頭擰緊后，韌環(huán)的外表面不能緊貼接口內(nèi)部，流動(dòng)相會(huì)泄露。如果繼續(xù)用力擰緊螺絲，韌環(huán)會(huì)被繼續(xù)往里擠壓，最終達(dá)到密封，然而接頭就不再適合接口較深的色譜柱了。當(dāng)伸出的管路長(zhǎng)度不夠（如圖6B），管路與接口底部會(huì)形成直徑達(dá)1/16英寸的空腔，這個(gè)空腔會(huì)造成色譜峰的展寬，危害柱效。假如堅(jiān)持使用不銹鋼連接色譜柱，最好為每一個(gè)品牌的色譜柱準(zhǔn)備一根做好接頭的管路。