單細(xì)胞測序?qū)ｎ}——血液篇

吉?jiǎng)P基因

2022.8.31

血液是流動(dòng)在哺乳動(dòng)物的血管和心臟中的一種紅色不透明黏稠液體，主要由血漿、血細(xì)胞（紅細(xì)胞、白細(xì)胞）和血小板組成。外周血是除骨髓之外的血液，其中的淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞)參與機(jī)體的特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)。許多疾病與外周血密切相關(guān)，包括急性髓系白血病(AML)、慢性淋巴細(xì)胞性白血病等，同時(shí)，血液中免疫細(xì)胞的類型及其占比的動(dòng)態(tài)變化、免疫圖譜等也可以反應(yīng)包括三陰性乳腺癌等許多疾病在免疫療法與化療聯(lián)合應(yīng)用后的治療效果。

本文對部分將單細(xì)胞測序技術(shù)應(yīng)用于探索病原暴露后外周血PBMC中環(huán)境特異性的基因表達(dá)調(diào)控、新冠肺炎的免疫反應(yīng)機(jī)制以及與季節(jié)性流感病毒的異同點(diǎn)、大顆粒淋巴細(xì)胞白血?。═-LGLL）中非白血病免疫系統(tǒng)的功能等相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行導(dǎo)讀，希望為大家的單細(xì)胞相關(guān)研究帶來啟發(fā)。

案例一

PBMC單細(xì)胞RNA測序揭示了病原暴露后廣泛且環(huán)境特異性的基因表達(dá)調(diào)控

研究目的：通過單細(xì)胞RNA測序揭示病原暴露后外周血PBMC中廣泛且環(huán)境特異性的基因表達(dá)調(diào)控

樣本信息：120個(gè)個(gè)體（體外不同病原菌刺激3h/24h）的PBMC樣本

測序策略：10x平臺(tái)，單細(xì)胞測序（scRNA-seq）

捕獲細(xì)胞數(shù)：約1300,000個(gè)細(xì)胞

結(jié)論：對120個(gè)縱向暴露于三種不同病原體的個(gè)體外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）進(jìn)行單細(xì)胞RNA測序后發(fā)現(xiàn)，在影響基因如何影響基因表達(dá)(如eQTL)和共表達(dá)(即共表達(dá)QTL)的環(huán)境方面，細(xì)胞類型特異性是比病原體特異性更突出的因素。PBMC對病原菌刺激反應(yīng)最強(qiáng)，71.4%受病原菌暴露影響基因表達(dá)的遺傳變異體(即響應(yīng)QTL)也影響基因之間的共表達(dá)。對CLEC12A基因的通路分析顯示，細(xì)胞類型、暴露時(shí)間和基因背景依賴的共表達(dá)相互作用，在PBMC中暴露3小時(shí)后，干擾素(IFN)通路特異性富集。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中，通過計(jì)算機(jī)模擬分析，證實(shí)了IFN活性和CLEC12A共表達(dá)模式之間的遺傳背景依賴關(guān)系，表明CLEC12A可能是一個(gè)IFN調(diào)節(jié)基因。

案例二

變應(yīng)性鼻炎免疫治療后的單細(xì)胞免疫分析揭示致病性T2細(xì)胞的功能抑制和克隆轉(zhuǎn)化

研究目的：利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序研究舌下免疫治療(SLIT)前后抗原特異性T細(xì)胞的作用及變化

樣本信息：人外周血PBMC(啟動(dòng)SLIT前和啟動(dòng)后1年獲得)

測序策略：10x平臺(tái)，scRNAseq+TCRseq

捕獲細(xì)胞數(shù)：102,037 個(gè)細(xì)胞

結(jié)論：SLIT后的抗原刺激培養(yǎng)導(dǎo)致T2和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞克隆擴(kuò)增，且多數(shù)CD4 T細(xì)胞在治療前后保留CDR3區(qū)，提示SLIT產(chǎn)生抗原特異性克隆反應(yīng)和分化。然而，SLIT可減少功能性克隆T2細(xì)胞的數(shù)目，增加表達(dá)肌球蛋白(MSC)、TGF-β和IL-2的轉(zhuǎn)換型 T2細(xì)胞數(shù)目。軌跡分析提示，SLIT誘導(dǎo)T2轉(zhuǎn)型細(xì)胞克隆分化為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，揭示了SLIT促進(jìn)T2細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)并抑制其功能的部分機(jī)制。MSC可能是變應(yīng)性鼻炎的一個(gè)潛在的生物標(biāo)志物。

案例三

CD8+T大顆粒淋巴細(xì)胞白血病中白血病和非白血病免疫系統(tǒng)的單細(xì)胞特征

研究目的：通過單細(xì)胞測序探索T-LGLL中非白血病免疫系統(tǒng)的功能

樣本信息：外周血PBMC（11個(gè)T-LGLL樣本+6個(gè)健康對照）

測序策略：10x平臺(tái)，scRNAseq+TCR-seq

捕獲細(xì)胞數(shù)：>150,000個(gè)細(xì)胞

結(jié)論：T細(xì)胞大顆粒淋巴細(xì)胞白血病(T-LGLL)克隆型比健康的反應(yīng)性克隆型具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒性和耗竭。T-LGLL克隆型通過共刺激細(xì)胞-細(xì)胞相互作用、單核細(xì)胞分泌的促炎細(xì)胞因子和T-LGLL克隆分泌的IFNγ，比反應(yīng)性克隆與非白血病免疫細(xì)胞表現(xiàn)出更活躍的細(xì)胞交流。除了白血病細(xì)胞庫，T-LGLL中的非白血病T細(xì)胞庫也比其他癌癥和自身免疫性疾病更成熟、更具細(xì)胞毒性和克隆限制，72%的白血病T-LGLL克隆型與其非白血病庫具有相同的T細(xì)胞受體，通過可能的共同靶抗原將白血病和非白血病庫連接在一起。

案例四

圍手術(shù)期外周血PBMC動(dòng)態(tài)圖譜

研究目的：利用單細(xì)胞RNAseq探索圍手術(shù)期麻醉對免疫細(xì)胞的具體影響

樣本信息：人PBMC樣本（來自手術(shù)前/手術(shù)后0小時(shí)/24小時(shí)/48小時(shí)/全麻患者）

測序策略：10x平臺(tái)，scRNAseq + TCR-seq

捕獲細(xì)胞數(shù)：107,870個(gè)細(xì)胞

結(jié)論：麻醉0 h時(shí)，CD56 NK細(xì)胞簇?cái)?shù)改變，24和48 h時(shí)單核細(xì)胞簇?cái)?shù)增加。CD56 NK細(xì)胞的特征基因主要富集于Jak-STAT信號通路、細(xì)胞粘附分子(24 h)和碳代謝(48 h)， CD14單核細(xì)胞與其他細(xì)胞的通訊在術(shù)后0和48 h大幅下降。大手術(shù)創(chuàng)傷患者血漿細(xì)胞數(shù)量顯著增加，戊糖磷酸途徑富集。漿細(xì)胞與其他細(xì)胞之間的通訊在手術(shù)嚴(yán)重程度和麻醉形式之間有所不同。與吸入麻醉相比，靜脈麻醉引起細(xì)胞類型的主要變化，包括CD14單核細(xì)胞、漿細(xì)胞和MAIT細(xì)胞。對免疫細(xì)胞變化的保護(hù)將有利于麻醉/手術(shù)后的恢復(fù)。

案例五

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析揭示中性粒細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和感染的異質(zhì)性

研究目的：通過單細(xì)胞RNAseq確定中性粒細(xì)胞異質(zhì)性和分化景觀

樣本信息：外周血（人）+骨髓、外周血、脾臟（小鼠）

測序策略：10x平臺(tái)&BD平臺(tái)，單細(xì)胞測序（scRNA-seq）

捕獲細(xì)胞數(shù)：19,582個(gè)細(xì)胞

結(jié)論：8個(gè)中性粒細(xì)胞群體被定義為不同的分子特征。三個(gè)成熟的外周血中性粒細(xì)胞亞群來源于不同的成熟骨髓中性粒細(xì)胞亞群。在已知和未知轉(zhuǎn)錄因子的驅(qū)動(dòng)下，中性粒細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄過程中逐漸獲得殺微生物的能力，反應(yīng)了一種有效而平衡的中性粒細(xì)胞反應(yīng)的精細(xì)調(diào)節(jié)機(jī)制。細(xì)菌感染重組了中性粒細(xì)胞群體的遺傳結(jié)構(gòu)，改變了亞群體和初級中性粒細(xì)胞之間的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)變，以增強(qiáng)其功能，而不影響整體的異質(zhì)性。

案例六

單細(xì)胞RNA測序揭示阿爾茨海默病的B細(xì)胞相關(guān)分子生物標(biāo)志物

研究目的：利用單細(xì)胞測序探討阿爾茨海默病(AD)患者PBMCs中細(xì)胞亞群的差異

樣本信息：4例AD患者（2例早期，2例晚期）和2例正常對照的PBMC

測序策略：10x平臺(tái)，單細(xì)胞測序（scRNA-seq）

捕獲細(xì)胞數(shù)：46,244個(gè)細(xì)胞

結(jié)論：通過單細(xì)胞RNA-seq分析，發(fā)現(xiàn)AD患者血液中B細(xì)胞明顯減少，通過流式分選，發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞減少與患者的臨床癡呆評分密切相關(guān)；在AD早期，B細(xì)胞耗竭加速并加重AD小鼠的認(rèn)知功能障礙和Aβ負(fù)荷。隨著疾病進(jìn)展，B細(xì)胞中一些特異性上調(diào)和下調(diào)基因與AD密切相關(guān)；基于B細(xì)胞預(yù)測AD嚴(yán)重程度成為可能，這有助于識(shí)別臨床AD進(jìn)展。

案例七

遺傳祖先影響特定細(xì)胞類型對病毒感染的響應(yīng)

研究目的：利用單細(xì)胞測序探究不同遺傳祖先的人群對于病毒感染的細(xì)胞特異性響應(yīng)

樣本信息：歐洲和非洲籍男性的外周血PBMC

測序策略：10x平臺(tái)，單細(xì)胞測序（scRNA-seq）

捕獲細(xì)胞數(shù)：255,731個(gè)細(xì)胞

結(jié)論：較高水平的歐洲血統(tǒng)與早期感染中I型干擾素途徑活性增加相關(guān)，這預(yù)示著在以后的時(shí)間點(diǎn)病毒滴度降低。大量的群體相關(guān)變異是由基因祖先區(qū)分的精確表達(dá)數(shù)量性狀基因座解釋的。此外，在與新冠肺炎疾病嚴(yán)重程度相關(guān)的基因中，遺傳祖先相關(guān)基因豐富，這表明早期免疫反應(yīng)導(dǎo)致了多種病毒感染結(jié)果的祖先相關(guān)差異。

案例八

通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析評估性別和年齡對免疫細(xì)胞景觀的影響

研究目的：利用單細(xì)胞測序探究性別和年齡對免疫系統(tǒng)的影響

樣本信息：20例男女（包括年輕和老年）的外周血PBMC

測序策略：10x平臺(tái)，單細(xì)胞測序（scRNA-seq）

捕獲細(xì)胞數(shù)：174,684個(gè)細(xì)胞（39,828個(gè)年輕男性+43,552個(gè)年輕女性細(xì)胞+47,101個(gè)老年男性細(xì)胞+44,203個(gè)老年女性細(xì)胞）

結(jié)論：隨著年齡增長，男女之間免疫細(xì)胞差異增大，T細(xì)胞和B細(xì)胞在女性中更顯“活性”，相關(guān)的激活信號通路富集更加明顯。女性血液循環(huán)中有更多的漿細(xì)胞和更強(qiáng)的BAFF/APRIL系統(tǒng)，這與更強(qiáng)的適應(yīng)性免疫反應(yīng)相一致。相比之下，男性血液中NK細(xì)胞的比例更高，某些促炎基因的表達(dá)更高。

案例九

外周血單個(gè)核細(xì)胞的單細(xì)胞測序揭示了新冠肺炎和流感患者的不同免疫應(yīng)答情況

研究目的：利用單細(xì)胞測序探究新冠肺炎的免疫反應(yīng)機(jī)制以及與季節(jié)性流感病毒的異同點(diǎn)

樣本信息：不同疾病進(jìn)程的新冠患者與流感患者的PBMC（3例健康人/2例甲型流感病毒IAV感染患者/5例COVID-19患者）

測序策略：10x平臺(tái)，單細(xì)胞測序（scRNA-seq）

捕獲細(xì)胞數(shù)：46,022個(gè)細(xì)胞

結(jié)論：COVID-19和IAV患者血漿細(xì)胞均增加，COVID-19患者XIAP相關(guān)因子1 (XAF1)-、腫瘤壞死因子(TNF)和fas誘導(dǎo)的T細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，COVID-19 (STAT1和IRF3)與IAV (STAT3和NFκB)患者激活的信號通路不同，關(guān)鍵因子的表達(dá)存在顯著差異。這些因素包括新冠肺炎患者中白細(xì)胞介素（IL）6R和IL6ST表達(dá)相對增加，但與IAV患者相比，IL-6濃度同樣增加，支持臨床觀察到的COVID-19患者前炎癥因子增加。

案例十

單細(xì)胞測序揭示可預(yù)測慢性髓系白血病中伊馬替尼最初耐藥的細(xì)胞群

研究目的：利用單細(xì)胞測序探索在慢性髓系白血?。–ML）患者中靶向酪氨酸激酶抑制劑（TKIs）應(yīng)答者和非應(yīng)答者的分子差異

樣本信息：四名處于不同治療階段的CML患者外周血PBMCs

測序策略：10x平臺(tái)，單細(xì)胞測序（scRNA-seq）

捕獲細(xì)胞數(shù)：41,723個(gè)細(xì)胞

結(jié)論：在伊馬替尼不良應(yīng)答者中，與應(yīng)答者相比，患者特異性治療前獨(dú)特的干/祖細(xì)胞在外周血中富集。這些結(jié)果表明，某些慢性粒細(xì)胞白血病患者對TKIs的抵抗可能是固有的，而不是后天獲得的，非腫瘤免疫細(xì)胞類型也可能在分散患者對TKIs的反應(yīng)性方面發(fā)揮重要作用。

吉?jiǎng)P基因憑借多年在靶標(biāo)篩選及驗(yàn)證服務(wù)領(lǐng)域的技術(shù)積累，建立的標(biāo)準(zhǔn)化、工程化、系統(tǒng)化的GRP平臺(tái)，為中國研究型醫(yī)生提供科研服務(wù)，加快科研成果轉(zhuǎn)化。其中，多組學(xué)平臺(tái)包含高通量測序平臺(tái)和蛋白質(zhì)組學(xué)平臺(tái)：

·高通量測序平臺(tái)分為常規(guī)測序服務(wù)和單細(xì)胞測序服務(wù)：單細(xì)胞測序擁有10x和BD兩個(gè)平臺(tái)，提供單細(xì)胞RNA-seq、單細(xì)胞核測序、單細(xì)胞混樣RNA-seq、單細(xì)胞TCR/BCR、單細(xì)胞（RNA+ATAC）、空間轉(zhuǎn)錄組測序等服務(wù)；常規(guī)測序服務(wù)提供meRIP-seq（m6A/m1A/m7G/m5C 等RNA甲基化修飾測序）、acRIP-seq（ac4C RNA乙酰化修飾測序）、ATAC-seq、Ribo-seq（翻譯組測序）、mRNA/miRNA/LncRNA/circRNA-seq、全轉(zhuǎn)錄組測序（兩文庫/三文庫）、外泌體miRNA/LncRNA-seq、WGS/WES、WGBS、RRBS、BSAS等服務(wù)；

·蛋白質(zhì)組學(xué)平臺(tái)擁有多臺(tái)timsTOF Pro、Exploris 480高精度質(zhì)譜儀，專業(yè)領(lǐng)先的Spectronaut Plusar、Mascot等分析軟件，提供專業(yè)的4D、DIA、TMT、PRM、磷酸化修飾組、olink蛋白質(zhì)組等檢測服務(wù)，強(qiáng)大的機(jī)器學(xué)習(xí)算法、IPA分析、蛋白基因組分析服務(wù)，系統(tǒng)的生物標(biāo)志物、分子分型、藥物靶點(diǎn)、基因功能研究等解決方案，真正讓廣大研究型醫(yī)生的科研工作更省心、更省力、更高效。