新冠病毒檢測有了新方法，可一次聯(lián)合檢測多種新冠變異株

融智生物

2022.1.11

基于QuanNUA基因分型系統(tǒng)開發(fā)的用于SARS-CoV-2變異株分型檢測的方法，可同時檢測新冠毒株S基因7個突變位點(diǎn)9種突變分型用于新冠病毒及其變異毒株檢測。

該方法充分利用核酸質(zhì)譜技術(shù)的多位點(diǎn)檢測優(yōu)勢，準(zhǔn)確性高，適用于新冠變異株分型檢測；同時，該方法可實(shí)現(xiàn)樣本的高通量快速檢測，檢測周期短，從PCR擴(kuò)增到質(zhì)譜檢測，7h內(nèi)可完成96份樣本的檢測；而且，該方法靈活性高，當(dāng)出現(xiàn)新型新冠突變株時，可在現(xiàn)有檢測方案中添加特異性探針用于新增突變位點(diǎn)檢測。

該方法是為新冠病毒變異株分型提供一種快速、高通量，高準(zhǔn)確度的新型檢測方法。

自2019年以來，嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）已在全球范圍內(nèi)傳播。SARS COV-2病毒變異株的出現(xiàn)，使全球面臨第二波冠狀病毒疾病流行的危機(jī)。截至到2021年6月，SARS-CoV-2變異株主要有6種分型，包括B.1.1.7 (Alpha), B.1.351 , (Beta), B.1.429 (Epsilon), B.1.526 (lota), P.1 (Gamma) 以及 B.1.617.2 (Delta)變異株[1-2]。有研究表明，這些新冠變異株在SARS冠狀病毒S蛋白的受體結(jié)合域（RBD）中發(fā)生關(guān)鍵性突變，病毒的傳播效率增強(qiáng)，感染者臨床癥狀更為嚴(yán)重，病毒的免疫逃逸能力增強(qiáng)，并且降低當(dāng)前疫苗的免疫效果?[3-4]。

目前新冠變異株檢測的金標(biāo)準(zhǔn)方法是WGS測序技術(shù)[5]，但是該技術(shù)檢測成本高、檢測周期長，技術(shù)要求高，不適合大規(guī)模常規(guī)樣本篩選。qPCR技術(shù)、melting-temperature RT-PCR 技術(shù)以及基于CRISPR-Cas13a轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增技術(shù)[6-8]一般只適用于新冠變異株單個位點(diǎn)檢測。因此，有必要開發(fā)一種快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)并且適用于多位點(diǎn)檢測的技術(shù)應(yīng)用于當(dāng)前新冠突變株的分型檢測。本研究開發(fā)了一種基于多重PCR和MALDI-TOF MS聯(lián)用技術(shù)用于SARS-CoV-2變異株分型檢測的方法。

本研究開發(fā)了一種基于多重PCR和QuanNUA（MALDI-TOF MS）的方法用于SARS-CoV-2變異株分型檢測，實(shí)現(xiàn)在新冠毒株S基因檢測7個突變位點(diǎn)包括9種突變分型（HV6970del, N501Y, K417N, P681H, D614G, E484K, L452R, E484Q 和 P681R)用于 India (B.1.617)、UK (B.1.1.7)、 South African (B.1.351)、 California (B.1.429)、 New York (B.1.526)、 Brazilian (P.1)等6種新冠變異株的分型檢測。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容主要包括三部分：首先，使用核酸提取試劑盒對臨床樣本進(jìn)行病毒RNA提取，并基于RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增含SNP靶位點(diǎn)的目的基因；然后，通過特異性質(zhì)量探針進(jìn)行SNP位點(diǎn)延伸；最后，通過MALDI-TOF MS技術(shù)鑒定不同質(zhì)量探針分子量得到目的基因檢測結(jié)果(圖1)。

圖1▲

基于多重PCR和MALDI-TOF MS技術(shù)用于SARS-CoV-2變異株分型檢測的流程圖

使用QuanNUA基因分型系統(tǒng)檢測樣本的基因分型，該系統(tǒng)由融智生物提供，包括引物設(shè)計軟件、試劑盒、MALDI-TOF MS和操作軟件。檢測主要流程包括核酸反應(yīng)產(chǎn)物制備和MALDI-TOF MS檢測。

制備核酸反應(yīng)產(chǎn)物

核酸樣本的制備過程中所需試劑和酶主要來源于融智生物提供的核酸檢測試劑盒，制備過程主要分為四步：多重RT-PCR擴(kuò)增、蝦堿性磷酸酶消化(SAP)、質(zhì)量探針延伸(MPE)和樹脂純化。

1）使用AgPath-ID 一步法RT-PCR試劑盒，對提取RNA核酸樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后多重PCR擴(kuò)增;

2）在PCR反應(yīng)結(jié)束后，將 PCR 產(chǎn)物用SAP處理，以去除反應(yīng)體系中游離的dNTPs;

3）加入MPE探針用于待檢測位點(diǎn)單堿基延伸反應(yīng)；

4）加入離子交換樹脂用于除鹽純化。

MALDI-TOF MS檢測

核酸反應(yīng)產(chǎn)物溶液經(jīng)樹脂純化后，離心取上清液。靶板上點(diǎn)樣，靶板通過QuanTOF控制器軟件自動加載進(jìn)質(zhì)譜儀。通過QuanNUA基因分型系統(tǒng)軟件，自動采集數(shù)據(jù)，并基于QuanNUA基因分型系統(tǒng)軟件對延伸位點(diǎn)的基因分型進(jìn)行分析判讀并輸出檢測報告。

本研究開發(fā)了一種基于多重PCR和QuanNUA（MALDI-TOF MS）的方法用于SARS-CoV-2新冠變異株分型檢測(表1)。該方法對SARS-CoV-2非變異株和變異株質(zhì)粒均可檢測到明顯的質(zhì)量探針延伸峰(圖2)，同時應(yīng)用于21例呼吸道病原體（9種細(xì)菌和12種呼吸道病毒）和非新冠感染病人的核酸樣本檢測，均未檢測到延伸峰，該方法具有良好的特異性；使用合成質(zhì)粒評估方法檢出限，方法最低檢出限在100-400拷貝，使用SARS-CoV-2非突變RNA核酸樣本稀釋液用于方法檢出限測定，方法最低檢出限為1560拷貝；應(yīng)用于20例臨床樣本的檢測，檢測結(jié)果如表2所示，與q-PCR和WGS測序結(jié)果進(jìn)行比對，對于q-PCR Ct值< 27的陽性樣本，基于QuanNUA核酸質(zhì)譜建立的方法進(jìn)行檢測，所有待測位點(diǎn)全部檢出，與qPCR結(jié)果全部一致，3例delta突變株可正確鑒定，說明該方法具有良好的鑒定準(zhǔn)確性，并可應(yīng)用于臨床樣本的新冠變異株分型檢測。

表1▲

用于SARS-CoV-2變異株分型檢測靶點(diǎn)的質(zhì)量探針

圖2▲?

SARS-CoV-2變異株分型檢測所用質(zhì)量探針延伸前(a)、SARS-CoV-2非變異株延伸后(b)、SARS-CoV-2突變質(zhì)粒（含HV69-70del, K417N, E484K, N501Y, D614G 和 P681H突變位點(diǎn)）延伸后(c)和SARS-CoV-2突變質(zhì)粒（含L452R, E484Q, 和P681R突變位點(diǎn)）延伸后(d)的質(zhì)譜圖

表2▲

基于多重PCR和QuanNUA的方法用于臨床樣本中SARS-CoV-2變異株分型檢測

Note:BALF,bronchoalveolarlavagefluid;NPS,nasopharyngeal swab

基于QuanNUA基因分型系統(tǒng)開發(fā)的用于SARS-CoV-2變異株分型檢測的方法，可同時檢測新冠毒株S基因7個突變位點(diǎn)上包括HV69-70del (Alpha), N501Y (Alpha, Beta和Gamma)、K417N (Beta), P681H (Alpha)、D614G (Alpha, Beta, Gamma, Epsilon, lota和Delta)、E484K (Beta和Gamma)、L452R (Delta和Epsilon)、P681R (Delta)和E484Q (B.1.617.1和B1.617.3)等9種突變分型用于SARS-CoV-2及其變異毒株檢測。該方法充分利用核酸質(zhì)譜技術(shù)的多位點(diǎn)檢測優(yōu)勢，準(zhǔn)確性高，適用于新冠變異株分型檢測；同時，該方法可實(shí)現(xiàn)樣本的高通量快速檢測，檢測周期短，從PCR擴(kuò)增到質(zhì)譜檢測，7h內(nèi)可完成96份樣本的檢測；而且，該方法靈活性高，當(dāng)出現(xiàn)新型新冠突變株時，可在現(xiàn)有檢測方案中添加特異性探針用于新增突變位點(diǎn)檢測。

該方法是為新冠病毒變異株分型提供一種快速、高通量，高準(zhǔn)確度的新型檢測方法。

參考文獻(xiàn)

1.?Tang JW, Tambyah PA, Hui DS. 2021. Emergence of a new SARS-CoV-2 variant in the UK. J Infect 82:e27–e28.

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