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細(xì)胞治療產(chǎn)品，這些無(wú)菌防控的點(diǎn)，你關(guān)注了嗎？
前言
無(wú)菌產(chǎn)品對(duì)于無(wú)菌防控的目的是為了控制產(chǎn)品對(duì)于微生物、微粒和熱原的污染風(fēng)險(xiǎn)，從而確保產(chǎn)品的安全性。細(xì)胞治療產(chǎn)品作為無(wú)菌產(chǎn)品的一種，因其生產(chǎn)固有的特點(diǎn)，自人體采集細(xì)胞后，需要通過(guò)全程無(wú)菌操作來(lái)進(jìn)行產(chǎn)品的生產(chǎn)，無(wú)法通過(guò)終端滅菌等方法或技術(shù)進(jìn)行控制。因此對(duì)整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程中各要素的無(wú)菌保證要求有一定程度的挑戰(zhàn)，以下這些無(wú)菌防控的理念和思考方向，可進(jìn)行關(guān)注。
無(wú)菌防控管理可總結(jié)為無(wú)菌防控技術(shù)與在線管理的結(jié)合。
無(wú)菌防控技術(shù)
定義：指的是保持無(wú)菌物品、無(wú)菌區(qū)域、無(wú)菌產(chǎn)線及產(chǎn)品不被污染、防止微生物污染的一系列技術(shù)手段，包括可確保無(wú)菌保證狀態(tài)的硬件、耗材及無(wú)菌操作技術(shù)。
屬于技術(shù)層面，總結(jié)為：懂、防、測(cè)
識(shí)別風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)（懂） → 制定硬軟件防控措施（防）→ 確定檢測(cè)手段（測(cè)）
無(wú)菌在線管理
定義：指的是基于產(chǎn)品的無(wú)菌保證要求，在現(xiàn)有無(wú)菌技術(shù)的基礎(chǔ)上制定的一系列確保無(wú)菌狀態(tài)維持和有效運(yùn)作的管理手段。
屬于管理層面，總結(jié)為：行、補(bǔ)、管
有效執(zhí)行（行） → 持續(xù)改進(jìn)PDCA，如CAPA（補(bǔ)） → 系統(tǒng)閉關(guān)管理（管）
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《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》附錄：細(xì)胞治療產(chǎn)品（征求意見(jiàn)稿）中對(duì)于該產(chǎn)品的污染防控做出了明確的要求，其中第二章的第四節(jié)第四條指出：
【防止污染和交叉污染】鑒于供體材料的可變性及可能含有傳染性疾病的病原體，且培養(yǎng)過(guò)程易導(dǎo)致污染，細(xì)胞治療產(chǎn)品的生產(chǎn)全過(guò)程應(yīng)當(dāng)尤其關(guān)注防止微生物污染。
細(xì)胞操作及培養(yǎng)的特點(diǎn)
1、起始材料為生物活性物質(zhì)，生產(chǎn)過(guò)程存在可變性
2、細(xì)胞操作及培養(yǎng)全過(guò)程是生物學(xué)過(guò)程也是無(wú)菌操作過(guò)程
3、培養(yǎng)過(guò)程所用的物料是污染微生物生長(zhǎng)的良好培養(yǎng)物質(zhì)
4、相對(duì)于微生物培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)的周期長(zhǎng)，對(duì)無(wú)菌要求非常高
5、依賴于設(shè)備性能、一次性無(wú)菌耗材
細(xì)胞污染的途徑
對(duì)于無(wú)菌防控特別需要注意的是外源性的生物污染
現(xiàn)今多數(shù)細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程會(huì)采用非密閉系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞操作及培養(yǎng)，這也是因?yàn)槠洳僮鞯谋憬菪圆⒒谄涔に嚨膫鹘y(tǒng)經(jīng)典操作，如在B+A環(huán)境中，使用生物安全柜進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)等各項(xiàng)操作。
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采用無(wú)菌工藝生產(chǎn)的無(wú)菌藥品，其無(wú)菌保證水平取決于生產(chǎn)流程的整體設(shè)計(jì)及管理，建議注意以下三個(gè)模塊。
一、無(wú)菌操作人員的管理及培訓(xùn)
與無(wú)菌管控相關(guān)的包含以下內(nèi)容
1、人員健康
2、穿戴適宜的潔凈工作服
3、正確的更衣和洗手
4、正確的潔凈室操作行為
5、潔凈區(qū)內(nèi)的人數(shù)控制及活動(dòng)區(qū)域限制
6、定期生物安全防護(hù)、無(wú)菌操作及意識(shí)培訓(xùn)
7、外來(lái)人員管理
舉 例
GMP細(xì)胞治療附錄第三章人員的第九條中規(guī)定：
【人員安全防護(hù)培訓(xùn)】從事細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)、質(zhì)量保證、質(zhì)量控制及其他相關(guān)人員（包括清潔、維修人員）應(yīng)當(dāng)經(jīng)過(guò)生物安全防護(hù)的培訓(xùn)，尤其是經(jīng)過(guò)預(yù)防經(jīng)供體材料傳播疾病方面的知識(shí)培訓(xùn)，以防止傳染性疾病的病原體在物料、產(chǎn)品和人員之間傳播以及對(duì)環(huán)境潛在的影響。
此條特別強(qiáng)調(diào)了從事細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)并與產(chǎn)品可能接觸的人員的安全防護(hù)培訓(xùn)要求，重點(diǎn)是防護(hù)經(jīng)供體材料傳播的疾病。由于供體材料來(lái)源于人體，因此可能攜帶的傳染基本也是人源性的，對(duì)于操作人員來(lái)說(shuō)具有較高風(fēng)險(xiǎn)。
二、無(wú)菌技術(shù)的充分性
這里的無(wú)菌技術(shù)指的是包含可確保無(wú)菌保證狀態(tài)的硬件、耗材及無(wú)菌操作技術(shù)，其中特別值得注意的是硬件，硬件是最開(kāi)始的基礎(chǔ)模塊，就跟造房子一樣，房子（硬件）要堅(jiān)固且布局合理，配套家具（耗材）及生活使用（無(wú)菌操作技術(shù)），才能讓無(wú)菌技術(shù)發(fā)揮充分。以下要求可供參考：
1、硬件應(yīng)依產(chǎn)線無(wú)菌要求設(shè)計(jì)、選型及采購(gòu)
2、首次確認(rèn)/驗(yàn)證非常重要，并注意制定合理的再確認(rèn)/驗(yàn)證周期
3、確保定期且有效的維護(hù)維保
4、確保人員的正確操作
5、確保計(jì)量器具定期校驗(yàn)，如檢測(cè)探頭，配件定期檢測(cè)更換，如HEPA
舉 例
如在T細(xì)胞分離、活化、修飾改造及擴(kuò)增階段使用的生物安全柜，其最重要的功能就是確保潔凈環(huán)境并進(jìn)行生物保護(hù)。其排風(fēng)系統(tǒng)是負(fù)壓外排式，既保護(hù)內(nèi)環(huán)境：產(chǎn)品，又保護(hù)外環(huán)境：操作人員，減少由于氣溶膠暴露導(dǎo)致培養(yǎng)物交叉污染及人員感染。
雖然在進(jìn)行供體采集前，會(huì)對(duì)供者進(jìn)行身體健康及傳染病檢查，但在生產(chǎn)過(guò)程中依舊難以避免產(chǎn)品被污染的風(fēng)險(xiǎn)。因此在整個(gè)產(chǎn)品生命周期中，需要嚴(yán)格控制細(xì)胞被污染的可能，不僅僅是傳染病的污染也包括微生物的污染。
那么對(duì)于生物安全柜的篩選，
首先，必須考慮生物安全柜的安全等級(jí)以滿足生物防護(hù)需求，
再者，日常的使用及維護(hù)時(shí)，也應(yīng)注意以下內(nèi)容：
1、定期檢查HEPA泄漏率，并日常注意壓差變化
2、定期檢測(cè)工作風(fēng)速
3、使用前后紫外燈照射消毒
4、使用時(shí)注意盡量不要阻擋回風(fēng)口
5、使用后及時(shí)清潔，并定期清潔操作臺(tái)下方，清潔時(shí)注意保護(hù)HPEA
6、注意發(fā)生污染后安全柜的處理方法。
三、無(wú)菌工藝的合理性及穩(wěn)定性
合理穩(wěn)定的無(wú)菌工藝是對(duì)產(chǎn)品安全性的保障，那么對(duì)于無(wú)菌工藝的確認(rèn)，培養(yǎng)基模擬試驗(yàn)尤為重要，其目的為：
1、對(duì)無(wú)菌工藝過(guò)程無(wú)菌保證水平的綜合評(píng)估（包括設(shè)備、人員、操作、生產(chǎn)環(huán)境等）
2、對(duì)無(wú)菌操作人員進(jìn)行資格確認(rèn)
3、確認(rèn)進(jìn)行重大變更后對(duì)無(wú)菌工藝的影響
4、作為問(wèn)題調(diào)查的手段
5、綜合反映生產(chǎn)線整體的無(wú)菌保證情況，但無(wú)法體現(xiàn)具體某批產(chǎn)品或某個(gè)產(chǎn)品的無(wú)菌性
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在GMP細(xì)胞治療附錄第二十六條，專門(mén)對(duì)培養(yǎng)基模擬試驗(yàn)進(jìn)行了描述。首次培養(yǎng)基模擬試驗(yàn)前，建議繪制流程圖，通過(guò)分析確定可能造成產(chǎn)品污染的風(fēng)險(xiǎn)因素，特別是一些高風(fēng)險(xiǎn)操作步驟，風(fēng)險(xiǎn)分析中應(yīng)覆蓋產(chǎn)線中的暴露設(shè)計(jì)、設(shè)備、人員、環(huán)境等各方面。
設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案時(shí)應(yīng)結(jié)合生產(chǎn)、QA及QC微生物崗位人員的意見(jiàn)，共同制定及修訂。在成功通過(guò)培養(yǎng)基模擬試驗(yàn)的首次驗(yàn)證后，可采用括號(hào)法或矩陣法或聯(lián)用方法每班次半年再進(jìn)行一次培養(yǎng)基模擬試驗(yàn)，關(guān)于括號(hào)法及矩陣法可參考ICH Q1D以及EU GMP 附錄15。
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舉 例
如細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程中細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程時(shí)間較長(zhǎng)，進(jìn)行模擬時(shí)會(huì)占用較長(zhǎng)時(shí)間，可使用風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方式進(jìn)行評(píng)價(jià)，以縮短某些操作的時(shí)長(zhǎng)，特別應(yīng)注意培養(yǎng)環(huán)境，確保符合法規(guī)的潔凈度要求，免受微生物污染。
另外培養(yǎng)溫度也是關(guān)鍵點(diǎn)，一方面，無(wú)菌工藝中的污染微生物培養(yǎng)需要穩(wěn)定的溫度，另一方面，在實(shí)際產(chǎn)品操作過(guò)程中，細(xì)胞治療產(chǎn)品的治療機(jī)理是通過(guò)細(xì)胞本身的生物學(xué)活性產(chǎn)生的，而人體細(xì)胞通常對(duì)溫度等因素比較敏感，因此在生產(chǎn)操作、檢驗(yàn)等過(guò)程中，均應(yīng)確保穩(wěn)定的溫度。
無(wú)菌管控管理的難點(diǎn)
軟件：人員無(wú)菌意識(shí)薄弱
背后的原理一知半解，無(wú)菌操作無(wú)法舉一反三
硬件：無(wú)菌硬件技術(shù)有待提高
硬件（含設(shè)備軟件）不足，人工操作過(guò)多
體系：缺少系統(tǒng)的無(wú)菌保證體系運(yùn)維
無(wú)菌保證SME專家缺失，出問(wèn)題返過(guò)去查，時(shí)間長(zhǎng)且復(fù)雜
?總結(jié)
細(xì)胞治療產(chǎn)品，生產(chǎn)過(guò)程非常個(gè)性化，原始樣本的獲取，需要從獨(dú)立的人體獲得，產(chǎn)成品最終再次回到人體，患者一般都是重大疾病，其本身對(duì)于外源污染的抵御能力就較弱。因此，在產(chǎn)品的制備過(guò)程中，安全性非常關(guān)鍵，無(wú)菌防控的良好管理，可以有效預(yù)防外源污染的引入，減少產(chǎn)品制備中相關(guān)偏差導(dǎo)致的不良品。
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