熱門技術(shù)解讀 | 單細胞測序研究——肝臟篇

吉凱基因

2021.10.27

肝臟是消化系統(tǒng)中最大的消化腺，也是人體內(nèi)臟里最大的器官。作為消化器官，肝臟參與糖、脂類、蛋白質(zhì)三大基本物質(zhì)的代謝，還參與維生素的合成、分解和儲存、核酸代謝、激素的生物轉(zhuǎn)化以及膽紅素和膽酸的代謝。而作為人體內(nèi)最大的解毒器官，肝臟不僅可對多種來源的毒物和廢物以及對肝臟有毒性的藥物等進行解毒并以無害物質(zhì)的形式分泌到膽汁或血液排出體外，而且還有造血和凝血等作用。

對肝臟細胞及其基因表達譜的全面了解，為多角度理解肝臟及肝癌相關(guān)細胞特征提供了極有價值的數(shù)據(jù)資源，可為各種肝臟相關(guān)疾病提供更精確的治療策略。本文對部分將單細胞測序技術(shù)應(yīng)用于了解肝臟細胞的組成及其免疫微環(huán)境、構(gòu)建大腸癌肝轉(zhuǎn)移的時空免疫景觀、探索基因表達和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變?nèi)绾未龠M肝細胞向膽道上皮細胞的轉(zhuǎn)變、解析肝細胞癌的轉(zhuǎn)錄組表型與遺傳異質(zhì)性等相關(guān)文獻進行導(dǎo)讀，希望為大家的單細胞相關(guān)研究帶來啟發(fā)。

單細胞水平下大腸癌肝轉(zhuǎn)移

的時空免疫景觀

研究目的：利用單細胞RNA測序和空間轉(zhuǎn)錄組測序探索結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的免疫圖譜

樣本信息：未治療及新輔助化療結(jié)直腸癌患者的結(jié)直腸癌(CRC)，鄰近結(jié)腸，肝轉(zhuǎn)移(LM)，鄰近肝，淋巴結(jié)(LN)沿結(jié)腸，外周血單核細胞(PBMC)

測序策略：10×平臺，單細胞測序（scRNA-seq）+空間轉(zhuǎn)錄組測序（Spatial Transcriptomics）

捕獲細胞數(shù)：79,703個（來自11個未治療患者）+36,284個（來自5個新輔助化療進展性/穩(wěn)定性患者）+62,643個（來自4個新輔助化療部分反應(yīng)患者）

結(jié)論：轉(zhuǎn)移性微環(huán)境經(jīng)歷了免疫抑制細胞如MRC1+，CCL18+，M2樣巨噬細胞的顯著空間重編程。研究人員進一步開發(fā)了一種量化單細胞代謝的計算管道scMetabolism，并觀察到這些巨噬細胞具有增強的代謝活性。新輔助化療可以阻斷這種狀態(tài)，并在反應(yīng)性患者中恢復(fù)抗腫瘤免疫平衡，而非反應(yīng)性患者則惡化為更具抑制性的狀態(tài)。

機體的轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳變化驅(qū)動

肝臟學中的細胞可塑性

研究目的：利用單細胞RNA測序探索與膽道重編程相關(guān)的表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄變化

樣本信息：小鼠肝臟組織

測序策略：10×平臺，單細胞測序（scRNA-seq）

捕獲細胞數(shù)：18,000多個細胞

結(jié)論：肝細胞在膽道重編程過程中發(fā)生廣泛的染色質(zhì)和轉(zhuǎn)錄變化，導(dǎo)致表觀遺傳和基因表達譜與天然BECs相似，但又不同。重編程涉及膽汁分子特征的逐漸積累，而不需要離散的中間產(chǎn)物。矛盾的是，通過Smad4的典型TGF-β信號似乎抑制了膽道重編程，這表明TGF-β可以促進或抑制膽道分化，這取決于該通路的下游成分參與。

I型膠原的腫瘤限制可對抗癌癥相關(guān)

成纖維細胞的腫瘤促進作用

研究目的：利用單細胞RNA測序探索腫瘤相關(guān)成纖維細胞(CAF)促進或抑制腫瘤的潛在機制

樣本信息：小鼠肝臟組織

測序策略：10×平臺，單細胞測序（scRNA-seq）

捕獲細胞數(shù)：NA（文章未提供）

結(jié)論：肝星狀細胞（HSC）是小鼠CAF的主要來源，而HSC的缺失或所有CAF的缺失可降低結(jié)直腸和胰腺促結(jié)締組織增生性轉(zhuǎn)移瘤的腫瘤生長和死亡率，但在非結(jié)締組織增生性轉(zhuǎn)移瘤中則無此作用。由肌纖維母細胞CAF-分泌（myCAF-分泌）透明質(zhì)酸和炎性CAF-分泌（iCAF-分泌）肝細胞生長因子（HGF）介導(dǎo)的直接與腫瘤的相互作用，可作為腫瘤促進機制。這些作用被myCAF表達的I型膠原所抑制，I型膠原通過機械作用抑制腫瘤擴散和生長。

早期復(fù)發(fā)的肝細胞癌生態(tài)系統(tǒng)

的單細胞景觀

研究目的：利用單細胞RNA測序探索肝癌原發(fā)和復(fù)發(fā)腫瘤的免疫微生態(tài)差異

樣本信息：人類肝臟組織

測序策略：SMART-seq2平臺，單細胞測序（scRNA-seq）

捕獲細胞數(shù)：16,498個細胞

結(jié)論：在兩個獨立隊列中，與原發(fā)腫瘤相比，早期復(fù)發(fā)腫瘤的調(diào)節(jié)性T細胞水平降低，樹突狀細胞(DCs)增加，浸潤性CD8+T細胞增加。復(fù)發(fā)性腫瘤中的CD8+ T細胞過表達KLRB1 (CD161)，并表現(xiàn)出一種天然的低細胞毒性狀態(tài)，低克隆擴增，與原發(fā)性肝癌中觀察到的經(jīng)典衰竭狀態(tài)不同。這些細胞的富集與較差的預(yù)后有關(guān)。差異基因表達和相互作用分析揭示了復(fù)發(fā)性腫瘤細胞潛在的免疫逃避機制，抑制DC抗原呈遞并招募先天性CD8+T細胞。

肝損傷后肝竇相關(guān)細胞的轉(zhuǎn)錄動力學

研究目的：利用單細胞RNA測序探索肝竇細胞損傷纖維化形成過程中細胞轉(zhuǎn)變之間的功能關(guān)系

樣本信息：小鼠肝臟組織

測序策略：10×平臺，單細胞測序（scRNA-seq）

捕獲細胞數(shù)：約20,000個細胞

結(jié)論：肝星狀細胞軌跡的加權(quán)基因相關(guān)網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)了核心基因，這些基因的表達被證明是非酒精性脂肪性肝炎(NASH)患者晚期纖維化的高度預(yù)測因子。在損傷抑制基因模塊的核心成員中，鑒定出質(zhì)膜囊泡相關(guān)蛋白(PLVAP)是一種小鼠和人類造血干細胞大量表達的蛋白。PLVAP表達在激活的造血干細胞損傷時被抑制，因此可能定義了迄今為止未知的造血干細胞在慢性肝病微循環(huán)交換及其破壞中的作用。

在單細胞水平上探索人肝硬化

的纖維化生態(tài)位

研究目的：利用單細胞RNA測序剖析人體器官纖維化的細胞和分子基礎(chǔ)

樣本信息：人類肝臟組織

測序策略：10×平臺，單細胞測序（scRNA-seq）

捕獲細胞數(shù)：100,000余個細胞

結(jié)論：研究發(fā)現(xiàn)了一個疤痕相關(guān)的TREM2+CD9+巨噬細胞亞群，該亞群在肝纖維化中擴大，與循環(huán)單核細胞不同，并具有促纖維化作用。研究者定義了在肝硬化中擴張的ACKR1+和PLVAP+內(nèi)皮細胞，它們在肝硬化中擴張，局限于纖維化生態(tài)位，并促進白細胞的遷移。疤痕相關(guān)巨噬細胞、內(nèi)皮細胞和PDGFRα+膠原生成間充質(zhì)細胞之間的配體和受體相互作用的多系模型揭示了疤痕內(nèi)幾個促纖維化通路的活性，包括TNFRSF12A、PDGFR和NOTCH信號。

腫瘤細胞多樣性驅(qū)動肝癌的微環(huán)境重編程

研究目的：利用單細胞RNA測序探索肝癌生態(tài)系統(tǒng)的多樣化

樣本信息：肝癌患者的肝臟組織

測序策略：10×平臺，單細胞測序（scRNA-seq）

捕獲細胞數(shù)：5,115個細胞

結(jié)論：研究人員發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi)部和之間的惡性細胞存在不同程度的異質(zhì)性，腫瘤微環(huán)境（TME）的景觀也不同。轉(zhuǎn)錄組多樣性較高的腫瘤與患者較差的總體生存率相關(guān)。低氧依賴性血管內(nèi)皮生長因子表達在腫瘤多樣性和TME極化之間存在聯(lián)系。此外，來自異質(zhì)性較高腫瘤的T細胞顯示出較低的溶細胞活性。這些結(jié)果提供了對肝癌多樣化生態(tài)系統(tǒng)及其對患者預(yù)后的影響的見解。

解碼人類胚胎肝臟造血

研究目的：利用單細胞RNA測序探索人類血液和免疫細胞在發(fā)育過程中的組成

樣本信息：人類肝臟、皮膚、腎臟和卵黃囊組織

測序策略：SMART-seq2平臺，單細胞測序（scRNA-seq）

捕獲細胞數(shù)：212,979個細胞（138,575個肝臟細胞+54,690個皮膚細胞+9,643個腎臟細胞+10,071個卵黃囊細胞）

結(jié)論：研究人員推斷造血干細胞和多能祖細胞（HSC / MPP）的分化軌跡，并評估組織微環(huán)境對血液和免疫細胞發(fā)育的影響，揭示了胎兒皮膚中的生理性紅細胞生成以及卵黃囊中肥大細胞、自然殺傷細胞和先天性淋巴細胞前體的存在。證實了妊娠期間胎兒肝臟的造血成分不再以紅細胞為主，同時伴隨著HSC / MPPs分化潛能的平行變化。該研究繪制的胎兒肝臟造血系統(tǒng)綜合圖譜為兒科血液和免疫疾病的研究提供了藍圖，并為HSC / MPP的治療潛力提供了參考。

人類肝臟的單細胞 RNA 測序揭示了不同的肝內(nèi)巨噬細胞群

研究目的：利用單細胞RNA測序探索組成人類肝臟的細胞及其免疫微環(huán)境

樣本信息：人類肝臟組織

測序策略：10×平臺，單細胞測序（scRNA-seq）

捕獲細胞數(shù)：8,444個細胞

結(jié)論：利用基因表達模式、流式細胞術(shù)和免疫組織化學檢測，研究人員鑒定了20個離散的肝細胞、內(nèi)皮細胞、膽管細胞、肝星狀細胞、B細胞、常規(guī)和非常規(guī)T細胞、NK樣細胞以及不同的肝內(nèi)單核細胞/巨噬細胞群。該研究以單細胞分辨率呈現(xiàn)了人類肝臟的全面視圖，概述了肝臟中駐留細胞的特征，并提供了人類肝臟免疫微環(huán)境的圖譜。

#10

通過單細胞測序揭示肝癌中

浸潤性T細胞的景觀

研究目的：利用單細胞RNA測序探索肝癌微環(huán)境中的免疫圖譜，揭示腫瘤中的T細胞和其他部位T細胞的差異

樣本信息：人類肝臟組織、外周血

測序策略：SMART-seq2平臺，單細胞測序（scRNA-seq）

捕獲細胞數(shù)：5,063個細胞

結(jié)論：根據(jù)單細胞轉(zhuǎn)錄譜，結(jié)合T細胞受體（TCR）序列，根據(jù)其分子和功能特性確定了11個T細胞亞群。在肝細胞癌（HCC）中，特定亞群如耗竭性CD8+T細胞和Treg優(yōu)先富集并可能克隆擴增，研究人員確定了每個亞群的特征基因。其中一個基因Layilin在激活的CD8+T細胞和Treg上上調(diào)，并在體外抑制CD8+T細胞功能，可能作為一個免疫療法的新靶點。該研究提供了極有價值的數(shù)據(jù)資源，為多角度理解肝癌相關(guān)的免疫特征奠定了基礎(chǔ)。

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吉凱基因憑借多年在靶標篩選及驗證服務(wù)領(lǐng)域的技術(shù)積累，建立的標準化、工程化、系統(tǒng)化的GRP平臺，為中國研究型醫(yī)生提供科研服務(wù)，加快科研成果轉(zhuǎn)化，其中，單細胞測序擁有10x和BD兩個平臺，提供單細胞RNA-seq、單細胞核測序、單細胞混樣RNA-seq、單細胞ATAC-seq、單細胞（RNA+ATAC）、空間轉(zhuǎn)錄組測序等服務(wù)。