NGS測序技術(shù)的不同檢測方案
測序技術(shù)是單基因遺傳病診斷應(yīng)用的主要技術(shù)，針對檢測基因的范圍可大體分為單基因檢測技術(shù)和多基因檢測技術(shù)。單基因檢測是指針對某一特定基因進(jìn)行測序的技術(shù)，適用于具有特異疾病表型的疾病。單基因檢測技術(shù)中應(yīng)用最廣泛的是Sanger測序，也稱一代測序。Sanger測序因僅能檢測一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)基因，因此適用于明確可識別的特異性表型的疾病診斷。多基因檢測技術(shù)主要是NGS測序，也稱二代測序。可以對基因組的成百上千個(gè)基因、甚至全部人類基因進(jìn)行大規(guī)模的平行測序，同時(shí)對產(chǎn)生的數(shù)十萬至數(shù)百萬的數(shù)據(jù)進(jìn)行同時(shí)讀取。常有人把一代測序和二代測序比喻成“釣魚”和“捕魚”。
Sanger測序的優(yōu)勢是成本低、覆蓋度高，對于目標(biāo)非常小的測序任務(wù)，如驗(yàn)證某一個(gè)位點(diǎn)的變異，或者檢測幾個(gè)外顯子，則非常適用。其次準(zhǔn)確性相對高，準(zhǔn)確率可以達(dá)到99.999%。第三檢測周期相對短，只需要2至4周就能得到檢測結(jié)果。Sanger測序最大的應(yīng)用局限性就是通量低，只能對一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)基因變異導(dǎo)至的高度特異的臨床表型進(jìn)行確診。其次是靈敏度低，Sanger測序是以峰圖形式呈現(xiàn)，用于檢測純合或雜合變異，但是對于檢測樣本中體細(xì)胞嵌合體、線粒體DNA等低豐度變異則無法檢測到。另外Sanger測序只能對特定基因進(jìn)行檢測，有可能檢測到意義未名的變異（Variants of Unknown Significance，VUS），但無法實(shí)現(xiàn)新致病基因的科研發(fā)現(xiàn)。
今天隆重介紹的就是當(dāng)下測序的主要檢測技術(shù)——高通量測序（Next Generation Sequencing，NGS），該技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)多基因大規(guī)模平行測序，可以從根本上解決單基因遺傳病因異質(zhì)性、基因多、表型復(fù)雜造成診斷難的實(shí)際問題。NGS實(shí)驗(yàn)流程是一個(gè)文庫制備→芯片捕獲→測序→數(shù)據(jù)分析的過程，基于NGS測序技術(shù)有三類檢測方案：
一、NGS-目標(biāo)疾病類捕獲方案（Panel方案）
Panel檢測是針對某一特定類別疾病的相關(guān)基因，如下圖-中圖：
Panel檢測適用于以下幾種情況：
（1）基因研究清楚的特定表型的診斷。如遺傳性痙攣性截癱、腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、CMT等。
（2）重疊疾病表型的診斷。如肌病Panel，雖有重疊表型，但又屬于不同疾病類，可用不同Panel檢測。再如癲癇，遺傳代謝病引起的代謝性癲癇和幼嬰癲癇性腦病均以癲癇為主要表現(xiàn)，分屬不同類別，且有各自表型特點(diǎn)，也應(yīng)采用不同Panel檢測。
（3）屬于同一類致病機(jī)制或分子途徑的疾病。如離子通道病神經(jīng)系統(tǒng)疾病進(jìn)行Panel檢測。
Panel檢測技術(shù)優(yōu)勢：檢測基因數(shù)目少，使檢測成本相對低，數(shù)據(jù)分析速度快，整體檢測周期短。另一顯著的優(yōu)勢，在蛋白編碼區(qū)域能達(dá)到很深的測序深度與覆蓋度，這對臨床診斷來說至關(guān)重要，因?yàn)楦呱疃纫馕吨鴾?zhǔn)確率高。Panel檢測因?yàn)槭菍σ阎蜻M(jìn)行目標(biāo)基因檢測，最大的局限性就是只能檢測Panel內(nèi)的基因。如果疾病致病基因不在Panel里則不會(huì)被檢測到，隨著疾病的新的致病基因被發(fā)現(xiàn)，或?qū)Ψ堑湫捅憩F(xiàn)的認(rèn)識程度加深，有些Panel可能會(huì)因?yàn)榛虿蝗鴳?yīng)用受限，這就需要再重新設(shè)計(jì)Panel。
二、NGS-全部外顯子組捕獲方案（WES方案）
全外顯子組檢測（Whole Exome Sequencing，WES）（上圖-左），WES檢測不局限于特定選擇的基因，范圍是人類已知20000多基因的編碼區(qū)序列，大概是整個(gè)基因組的1-2%，但卻包含了基因變異的85%。因此，WES檢測是在已知基因下針對SNVs這種變異最全面的方案。據(jù)研究統(tǒng)計(jì)，孟德爾遺傳病通過WES檢測的陽性率可以達(dá)到22%至31%。神經(jīng)系統(tǒng)疾病用WES檢測診斷陽性率（30.6%）比非神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病陽性率（如：皮膚系統(tǒng)17.2%、血液系統(tǒng)疾病17.1%）更高。用WES方案檢測癲癇或共濟(jì)失調(diào)可以達(dá)到總體36.1%的陽性率。
WES檢測適用于：
（1）表現(xiàn)為遺傳異質(zhì)性疾病的診斷。如自閉癥或發(fā)育障礙、線粒體疾病，這類疾病常涉及多種表型系列，且致病機(jī)制復(fù)雜。
（2）一個(gè)患者表現(xiàn)出兩種或以上的完全獨(dú)立系統(tǒng)疾病的復(fù)雜情況。如：患者既有眼皮膚白化病又有中性粒細(xì)胞減少又有癲癇表現(xiàn)，這樣患者選擇方案時(shí)選兩個(gè)或兩個(gè)以上的Panel反而會(huì)增加成本。
（3）患者全身多系統(tǒng)受累。如：一些綜合征類疾病，像Kabuki綜合征，表現(xiàn)為特殊面容、骨骼發(fā)育障礙、多發(fā)畸形等?；騔ellweger綜合征，表現(xiàn)全身多發(fā)畸形、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、肝功能和腎功能異常等多種表現(xiàn)。
WES檢測優(yōu)勢是全面，是對全部基因的外顯子進(jìn)行檢測。相比于Panel，會(huì)有更大的發(fā)現(xiàn)新致病基因的可能性?？梢詸z測到編碼區(qū)的VUS變異，用于人類基因組外顯子研究非常重要。WES最大的挑戰(zhàn)就是數(shù)據(jù)分析，WES通常有150-200×的測序深度，平均測序深度不低于100×，并且20×深度的基因覆蓋度也是數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠的重要參考指標(biāo)。
三、NGS-全基因組測序方案（WGS方案）
全基因組測序（Whole Genome Sequencing，WGS）檢測范圍最全面，不用捕獲，是對整個(gè)基因組進(jìn)行檢測，不僅能檢測編碼區(qū)，還可以檢測到非編碼區(qū)以及調(diào)控區(qū)，以及一些結(jié)構(gòu)變異。但WGS的局限性也是顯而易見的。首先，因WGS是對整個(gè)基因組檢測，會(huì)檢測到很多內(nèi)含子和基因間區(qū)域內(nèi)變異，而這些變異的功能在很大程度上是未知的，因此這些被檢測的未知數(shù)據(jù)的分析解讀是一個(gè)難題。其次，如果保證數(shù)據(jù)深度（100×）和質(zhì)量的條件下，WGS會(huì)比WES高于3-5倍甚至更高的檢測成本。第三，由于數(shù)據(jù)量的增多，在數(shù)據(jù)存儲、數(shù)據(jù)分析、數(shù)據(jù)過濾注釋等方面需要建立的方法都要比WES更加復(fù)雜。最后，WGS無大樣本罕見變異參考，即使檢測到的數(shù)據(jù)，也可能無致病性分析的參考。
檢測方案的選擇要從患者實(shí)際患病情況出發(fā)，為患者選擇最適合方案以達(dá)到精準(zhǔn)診斷的目的。有兩點(diǎn)選擇標(biāo)準(zhǔn)：
一、表型越非特異越應(yīng)選擇相對全面的方案
表型異質(zhì)性與特異性示意圖（Wright CF et.al. Nat Rev Genet. 2018.）
當(dāng)一個(gè)疾病表型很確定時(shí)，只需要選擇相對明確的直接檢測，如圖，假如能確定囊性纖維化，只檢測CFTR基因即可，應(yīng)用NGS測序都已屬于過度檢測。而對于一些非特異性的我們也稱為遺傳異質(zhì)性表型，為達(dá)到更高陽性檢出率必須做相對大而全的方案。
二、Trio模式比先證者模式檢測更嚴(yán)謹(jǐn)
先證者模式是只對家系中第一個(gè)發(fā)現(xiàn)該病的患者（先證者）一個(gè)人進(jìn)行檢測，數(shù)據(jù)分析后有疑似致病性位點(diǎn)，再進(jìn)行父母或其他患病成員的家系Sanger測序驗(yàn)證。家系模式是對先證者及其父母三個(gè)人全部進(jìn)行NGS測序。Trio模式會(huì)提高陽性診斷率，如嚴(yán)重發(fā)育障礙患者，先證者模式WES陽性診斷率是28%，Trio-WES的陽性診斷率可以提高至40%，增加了12%的陽性診斷率。這是因?yàn)榧蚁的Ｊ娇梢詮倪z傳學(xué)上考慮見到更有意義的變異位點(diǎn)，如：De novo突變、純合突變、復(fù)合雜合突變、X連鎖疾病半合子突變、單親二倍體、家系表型-基因型共分離，通過家系篩查可以判斷變異致病性，有更強(qiáng)的遺傳學(xué)證據(jù)，同時(shí)避免出現(xiàn)先證者模式可能造成的假陽性結(jié)果。
隨著近年來高通量測序技術(shù)的發(fā)展，以及測序成本的降低，高通量測序技術(shù)已逐步替代經(jīng)驗(yàn)診斷為主導(dǎo)的單基因測序技術(shù)，成為遺傳病診斷的主要遺傳學(xué)檢測技術(shù)?；诟咄繙y序技術(shù)平臺，衍生出不同的檢測方案。不同檢測方案均有其檢測適應(yīng)癥、優(yōu)勢及局限性，在方案選擇上要充分考慮患者臨床表型，以及疾病與基因相關(guān)性進(jìn)行綜合評估，選擇能夠?yàn)榛颊邘碜詈迷\斷效果的檢測方案。當(dāng)下測序技術(shù)本身已不是瓶頸，核心關(guān)鍵在于高通量測序后得到的海量數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)分析與數(shù)據(jù)挖掘。運(yùn)用高通量測序技術(shù)，結(jié)合生物信息學(xué)分析、遺傳學(xué)分析、臨床表型分析等進(jìn)行多學(xué)科綜合分析與解讀，最終實(shí)現(xiàn)對單基因遺傳病患者進(jìn)行精準(zhǔn)病因?qū)W診斷。
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