乙醇沉淀蛋白質(zhì)原理和操作
鹽析法——多用于各種蛋白質(zhì)和酶的分離純化
在蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽以破壞蛋白質(zhì)的膠體穩(wěn)定性而使其析出,這種方法稱(chēng)為鹽析.常用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等.各種蛋白質(zhì)鹽析時(shí)所需的鹽濃度及pH不同,故可用于對(duì)混和蛋白質(zhì)組分的分離.例如用半飽和的硫酸銨來(lái)沉淀出血清中的球蛋白,飽和硫酸銨可以使血清中的白蛋白、球蛋白都沉淀出來(lái),鹽析沉淀的蛋白質(zhì),經(jīng)透析除鹽,仍保證蛋白質(zhì)的活性.調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液的pH至等電點(diǎn)后,再用鹽析法則蛋白質(zhì)沉淀的效果更好.鹽析法分為兩類(lèi),第一類(lèi)叫Ks分段鹽析法,在一定PH和溫度下通過(guò)改變離子強(qiáng)度實(shí)現(xiàn),用于早期的粗提液；第二種叫b分段鹽析法,在一定離子強(qiáng)度下通過(guò)改變PH和溫度來(lái)實(shí)現(xiàn),用于后期進(jìn)一步分離純化和結(jié)晶.影響鹽析的因素包括：蛋白質(zhì)濃度、離子強(qiáng)度和類(lèi)型、PH值、溫度等.針對(duì)溫度這一條,需要強(qiáng)調(diào)：在低離子強(qiáng)度或純水中,蛋白質(zhì)溶解度在一定范圍內(nèi)隨溫度增加而增加.但在高濃度下,蛋白質(zhì)、酶和多肽類(lèi)物質(zhì)的溶解度隨溫度上升而下降.在一般情況下,蛋白質(zhì)對(duì)鹽析溫度無(wú)特殊要求,可在室溫下進(jìn)行,只有某些對(duì)溫度比較敏感的酶要求在0-4℃進(jìn)行.
使用硫酸銨沉淀蛋白需要注意：硫酸銨中常含有少量的重金屬離子,對(duì)蛋白質(zhì)巰基有敏感作用,使用前必須用H2S處理：將硫酸銨配成濃溶液,通入H2S飽和,放置過(guò)夜,用濾紙除去重金屬離子,濃縮結(jié)晶,100℃烘干后使用.另外,高濃度的硫酸銨溶液一般呈酸性(PH=5.0左右),使用前也需要用氨水或硫酸調(diào)節(jié)至所需PH.
2.有機(jī)溶劑沉淀法——多用于生物小分子、多糖及核酸產(chǎn)品的分離純化；
有機(jī)溶劑的沉淀機(jī)理是降低水的介電常數(shù),導(dǎo)致具有表面水層的生物大分子脫水,相互聚集,最后析出.該法優(yōu)點(diǎn)在于：1)分辨能力比鹽析法高,即蛋白質(zhì)或其它溶劑只在一個(gè)比較窄的有機(jī)溶劑濃度下沉淀；2)沉淀不用脫鹽,過(guò)濾較為容易；3)在生化制備中應(yīng)用比鹽析法廣泛.但是,在常溫下,有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)往往引起變性.例如酒精消毒滅菌就是如此.因此,操作要求在低溫下進(jìn)行.有機(jī)溶劑的選擇首先是能和水混溶,使用較多的有機(jī)溶劑是乙醇、甲醇、丙酮,還有二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、乙腈和2-甲基-2,4戊二醇等.
3.等電點(diǎn)沉淀法——此法單獨(dú)應(yīng)用較少,多與其它方法結(jié)合使用；
兩性電解質(zhì)分子上的凈電荷為零時(shí)溶解度最低,不同的兩性電解質(zhì)具有不同的等電點(diǎn),以此為基礎(chǔ)可進(jìn)行分離.如工業(yè)上生產(chǎn)胰島素時(shí)
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焦點(diǎn)事件
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焦點(diǎn)事件
