利用差分脈沖伏安法和機器學(xué)習(xí)算法快速測定花椒的地理真實性和辣度
花椒（Zanthoxylum bungeanum，PZB））是一種廣受歡迎的辛辣調(diào)味品，廣泛應(yīng)用于亞洲美食中。它的特點是其獨特的刺痛感和麻木感，以及令人印象深刻的香氣。隨著亞洲美食在世界范圍內(nèi)的流行，對花椒的需求迅速增加，如今花椒已成為全球最大的木本香料作物，在中國的種植面積超過100萬公頃。
有效評估PZB產(chǎn)地和辛辣強度分別對其商業(yè)貿(mào)易和深加工的成功至關(guān)重要?；ń飞L區(qū)域的差異自然會導(dǎo)致PZB在香氣、麻味和外觀等品質(zhì)上存在差異。原產(chǎn)地是判斷PZB采購價格的主要依據(jù)。然而，在經(jīng)濟競爭的推動下，產(chǎn)地真?zhèn)我殉蔀镻ZB貿(mào)易中的問題，涉及普遍的錯誤標(biāo)簽和摻假。PZB摻假主要包括高質(zhì)量產(chǎn)地的PZB與類似的低質(zhì)量產(chǎn)地PZB的混合。然而，即使對專業(yè)人士來說，驗證PZB的地理真實性也是具有挑戰(zhàn)性的，因為這些作物在外觀上非常相似。盡管高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜法和頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法（HS-SPME-GC-MS）已被證明能有效準(zhǔn)確地確定原產(chǎn)地真?zhèn)?，這些程序缺乏便攜性且涉及的復(fù)雜操作使得它們在業(yè)務(wù)交易期間不方便進行實時檢測。
辛辣強度是PZB加工過程中質(zhì)量的重要指標(biāo)，主要歸因于特定的烷基酰胺，如山椒素、羥基山椒素、bungeanool和isobungeanool。目前，PZB辛辣度的評估主要依賴于專家的主觀判斷，但這種方法需要進行感官訓(xùn)練，并且在大規(guī)模測試樣本中受到味覺疲勞的限制。另一方面，目前用于測定PZB中烷基酰胺物質(zhì)含量的辛辣強度檢測方法，由于其強度不僅取決于烷基酰胺的含量，還取決于其成分，因此不能準(zhǔn)確反映人的感官體驗。由于其結(jié)構(gòu)差異，烷基酰胺表現(xiàn)出不同的辛辣強度。此外，對麻味的感官知覺會受到食物基質(zhì)中其他成分的影響，僅通過測量特定烷基酰胺含量難以獲得可靠的評價結(jié)果。
從上述分析中可以清楚地看出，需要一種高精度和便攜式的方法來解決PZB來源識別以及測量其辛辣強度所帶來的挑戰(zhàn)。近年來，一種基于電化學(xué)儀器的差分脈沖伏安法（DPV）作為一種靈敏、選擇性強的食品質(zhì)量評價工具而出現(xiàn)。在先前的研究中發(fā)現(xiàn)，DPV能夠產(chǎn)生PZB中多酚和烷基酰胺的伏安信號，從而顯示出區(qū)分不同PZB質(zhì)量的潛力。然而，不同成分的信號之間存在明顯的干擾，這阻礙了對各種PZB質(zhì)量特性的定量區(qū)分。為了提高電化學(xué)傳感器的選擇性和信號強度，許多研究探索了使用特殊材料進行電極修飾。也有報道稱，機器學(xué)習(xí)和電化學(xué)檢測的融合可以提供一種替代方法，能夠彌補傳統(tǒng)電化學(xué)方法的局限性，因為它在從復(fù)雜信號中提取有意義的見解方面優(yōu)于傳統(tǒng)方法。因此，機器學(xué)習(xí)方法在食品質(zhì)量監(jiān)測中越來越受到重視。
本研究旨在通過DPV和機器學(xué)習(xí)算法的結(jié)合，開發(fā)一種快速準(zhǔn)確的PZB地理真實性和辛辣強度檢測方法。首先，收集了中國14個產(chǎn)地的210份PZB樣品的DP伏安圖。然后，對支持向量機（SVM）、KNN、ANN和極限梯度增強（XGB）4種算法進行原產(chǎn)地、地理真實性和辛辣強度預(yù)測模型的優(yōu)化測試。此外，還介紹了所提方法中產(chǎn)地區(qū)分和辛辣強度量化的原理。本研究為PZB質(zhì)量評估儀器的開發(fā)提供了一條有前景的途徑。
Graphical abstract
圖1 PZB樣品的外觀和產(chǎn)地信息
圖2 數(shù)據(jù)庫建立
Results and Discussion
不同來源的PZB提取物溶液的DP伏安圖
如圖3a所示，在?0.2～1.4 V范圍內(nèi)呈現(xiàn)3～4個峰值。值得注意的是，不同地區(qū)的PZB的DP伏安表現(xiàn)出顯著的差異。S1、S2和S3在地理位置相近的地區(qū)（甘肅天水市）發(fā)育出相似的曲線模式，表明其組成相似。相反，同樣來自甘肅的S4在其DP伏安圖中顯示出一個明顯的陽極峰，約為0.6 V，表明與地區(qū)同類產(chǎn)品相比，存在不同的氧化還原活性物質(zhì)。此外，從山西獲得的S6和S7在0.2 V到0.7 V的電位范圍內(nèi)表現(xiàn)出明顯的伏安差異。山東產(chǎn)S8、S9、河北產(chǎn)S10、四川產(chǎn)S11、S12、S13、S14的DP伏安圖基本一致。
PZB的起源辨析
為了驗證DPV方法在原產(chǎn)地分析中的潛力，應(yīng)用PCA和LDA對數(shù)據(jù)進行降維，并對不同類別進行可視化。三維PCA評分圖結(jié)果如圖3b所示，其中前三個主成分的累計解釋方差為93.3%。雖然在同一來源樣本中存在一定的聚集趨勢，但不同來源樣本之間存在明顯的重疊，因此PCA不能提供PZB來源的明確區(qū)分。
由于PCA的局限性，采用LDA進行進一步的可視化。圖3c給出了利用KNN算法從二維LDA空間計算的決策邊界，該圖清楚地顯示了不同來源的PZB樣本之間存在明顯的分化，同一來源的PZB樣本存在明顯的聚類。DPV曲線有效地捕捉了各產(chǎn)地的變化和特征，便于綜合分析。然而，值得注意的是，樣本S4和S9之間存在相當(dāng)大的重疊，這對使用LDA進行區(qū)分構(gòu)成了挑戰(zhàn)。樣本S1、S2、S8和S11在邊界附近也存在部分重疊，導(dǎo)致誤分類。圖3c中由LDA得出的散點圖直觀地說明了各個樣本之間的相似性，為進一步分析奠定了基礎(chǔ)。LDA的起源區(qū)分能力的基本原理在于提取獨特的、可區(qū)分的特征的能力。LDA通過優(yōu)化特征的線性組合，使組間方差最大化，組內(nèi)方差最小化，保證同源樣本聚類緊密，同源樣本分離清晰。
為了進一步提高PZB起源識別模型的準(zhǔn)確性，評估了四種不同的機器學(xué)習(xí)技術(shù)，KNN、SVM、ANN和XGB。與LDA相比，這四種算法具有更靈活的模型結(jié)構(gòu)和參數(shù)設(shè)置，更適合問題需求。此外，他們都表現(xiàn)出處理非線性數(shù)據(jù)和模式的熟練程度，并且通常在處理高維數(shù)據(jù)集方面表現(xiàn)出增強的有效性。如表1所示，四種模型在訓(xùn)練集上都達到了100%的準(zhǔn)確率，但在測試集上的表現(xiàn)存在顯著差異。在測試模型中，ANN的識別率最高，達到100%，其次是SVM（92.8%）、KNN（86.5%）和XGB（78.5%）。
表1 三種模型的性能：用數(shù)據(jù)集1評估PZB原點分化模型
由于某些PZB樣本的接近，KNN表現(xiàn)不佳，從PCA和LDA分析中可以看出。KNN算法基于距離的特性確實使樣本區(qū)分具有挑戰(zhàn)性。XGB的性能不佳可能歸因于基于樹的集成模型對特征劃分和選擇的敏感性。過多的特征會放大過擬合的風(fēng)險。圖3d展示了最優(yōu)模型在測試集上的性能。人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)在實現(xiàn)最高識別率方面的成功強調(diào)了其在捕獲數(shù)據(jù)集中復(fù)雜的相互依賴性方面的能力，并展示了區(qū)分PZB起源的識別能力。這種改進可能歸因于自適應(yīng)特征表示學(xué)習(xí)能力，其中可以從原始數(shù)據(jù)中提取有用的特征，而無需進行特征工程。同樣，支持向量機的熟練程度可以歸因于它們在處理非線性關(guān)系和高維數(shù)據(jù)集方面的熟練程度。
與基于質(zhì)子核磁共振（1H NMR）和近紅外（NIR）的起源區(qū)分方法的準(zhǔn)確率分別為86.8%和87.5%相比，所提出的DPV方法的準(zhǔn)確率達到了100%。
摻假PZB的鑒定
雖然起源區(qū)分模型表現(xiàn)出較好的性能，但不同起源的PZB混合會大大降低PZB的精度。然而，仍然有有限的研究跟蹤摻假做法，這是一個普遍發(fā)生在PZB業(yè)務(wù)在PZB交易。為了建立一個可靠的模型來鑒定摻假的PZB，進一步制備了來自不同來源的含有不同量PZB的樣品。在評估四種不同機器學(xué)習(xí)算法的性能時，關(guān)注50%的欺詐率和未摻雜的樣本，并根據(jù)最佳的二值分類性能選擇最優(yōu)模型。如表1所示，KNN、XGB、SVM和ANN模型均取得了優(yōu)異的效果，其準(zhǔn)確率、精密度、召回率和AUC均超過90%。其中，KNN模型的準(zhǔn)確率最高，達到97.9%，準(zhǔn)確率和召回率接近95%甚至更高，AUC達到0.980。這些令人印象深刻的指標(biāo)表明，KNN模型是鑒定PZB樣品中摻假的最準(zhǔn)確和最強大的工具。
為了研究欺詐模型的識別閾值，隨后使用不同摻假率（20%、35%、50%、65%、80%）的樣本數(shù)據(jù)以及未摻假樣本的數(shù)據(jù)構(gòu)建模型。采用最優(yōu)XGB模型對這些數(shù)據(jù)集進行分析。在圖3e所示的分析結(jié)果中，很明顯，當(dāng)欺詐率降低時，模型的性能并沒有明顯惡化。KNN模型可以在20%的摻雜水平上有效地區(qū)分PZB樣品，準(zhǔn)確率為87.4%，從而證明了其在這方面的魯棒性和可靠性。
圖3 （a）不同產(chǎn)地PZB的平均DP伏安圖（甘肅S1-S4、山西S5、陜西S6-S7、山東S8-S9、四川S10-S14）；（b）所有DP伏安圖（210個樣品，210×400個變量）的PCA分?jǐn)?shù)圖（總方差為93.3%）；（c）基于KNN模型計算的PZB原產(chǎn)地鑒別決策邊界；（d）最佳PZB原產(chǎn)地分析模型測試集中的混淆矩陣；（e）最佳模型在不同PZB摻假率下的摻假鑒定準(zhǔn)確率
辛辣強度的感官評價
圖4a顯示了來自不同地區(qū)的PZB樣品的感官評價，并顯示了基于來源的辛辣強度的變化。PZB樣本來自不同起源隨后被排名的基礎(chǔ)上他們的刺激性強度如下：S1（25.33±3.91）≥S3（24.69±5.68）≥向（23.91±4.68）≥S12（21.64±5.41）≥S2（21.56±3.80）≥S14系列（20.09±4.55）≥S11（15.44±6.25）≥S10（12.31±5.26）≥S4（11.70±2.81）≥S6（11.61±4.20）≥S7（10.47±4.19）≥S9（9.38±4.42）≥S5（8.67±4.59）≥S8（7.30±4.06）。很明顯，這些辛辣強度值差異很大，代表了不同的PZB等級。其中，甘肅和四川（S1、S2、S3、S12和S13）的PZB樣品普遍表現(xiàn)出較高的刺鼻強度，而河北（S10）、山東（S8和S9）和陜西（S6和S7）的刺鼻強度較弱。此外，S13與S1、S3和S12具有較高的辛辣強度，而S14、S2和S11具有中等的辛辣強度。在先前的研究中，證明了PZB的總烷基酰胺含量與DP伏安圖中1.0 V左右的峰值電流強度之間存在很強的相關(guān)性。本研究結(jié)合圖3a所示不同生境PZB的DPV分析，大多數(shù)高刺鼻強度的PZB樣品在1.0 V左右出現(xiàn)明顯的峰值強度。這與先前的發(fā)現(xiàn)一致，確定烷基酰胺是PZB的主要刺激性化合物。不過，也有一些例外情況。例如，PZB樣品S7的烷基酰胺含量相對較高，但辛辣強度較低，而S12的烷基酰胺含量相對較低，但辛辣強度較高。這些例外表明，除了烷基酰胺外，還有其他成分對PZB的刺激性強度有影響。
圖4 （a）不同產(chǎn)地種植的PZB辛辣強度；（b）PZB辛辣強度的標(biāo)度和描述語義；（c）最佳PZB辛辣強度預(yù)測模型的測量值和預(yù)測值的散點圖；（d）用于建立PZB辛辣強度預(yù)測模型的每個特征的貢獻
PZB的辛辣強度預(yù)測
為了評估PZB的尖銳程度，在訓(xùn)練、驗證和測試數(shù)據(jù)集上使用R2和RMSE評估了四種不同學(xué)習(xí)算法的性能。表1總結(jié)了各模型得到的最優(yōu)結(jié)果，表S7給出了各模型使用的超參數(shù)。
在被測試的四種算法中，KNN算法的訓(xùn)練R2值最高，為1.00，SVM算法的訓(xùn)練R2值最低，為0.952。交叉驗證的R2值范圍為0.752～0.896，表明不同算法的性能存在差異。值得注意的是，基于訓(xùn)練集和交叉驗證集的R2和RMSE之間的差異（分別為ΔR2＝0.048和ΔRMSE＝0.98），ANN算法在兩個集之間表現(xiàn)出最小的性能差異，表明沒有明顯的過擬合問題。相反，KNN算法的性能下降更為明顯，與訓(xùn)練集相比，其他兩種算法都表現(xiàn)出較差的性能，顯著下降，這表明了明顯的過擬合問題。然而，這個問題可以通過擴展數(shù)據(jù)集得到潛在的緩解。
在測試數(shù)據(jù)集上評估預(yù)測性能時，所有算法的R2范圍為0.743～0.918。ANN算法的R2最高，為0.918，XGB算法的R2最低，為0.743。這些測試數(shù)據(jù)集結(jié)果與交叉驗證結(jié)果一致。因此，人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法是評估PZB辛辣強度最有效的模型。圖4c展示了散點圖，說明了訓(xùn)練和測試中表現(xiàn)最好的模型的回歸結(jié)果。x軸表示實際值，y軸表示預(yù)測值，與對角線緊密對齊的散點分布表明模型性能較好。當(dāng)超參數(shù)設(shè)置為num_layers為4，隱藏大小為128時，獲得了最優(yōu)的ANN模型。這種對人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型架構(gòu)的約束抑制了過度的復(fù)雜性和過度擬合的可能性。因此，通過結(jié)合dropout和正則化策略，ANN算法有效地防止了網(wǎng)絡(luò)對訓(xùn)練數(shù)據(jù)中的噪聲過于敏感。
另一方面，由于感官評價數(shù)據(jù)波動較大，辛辣強度預(yù)測模型的性能受到限制。盡管如此，本研究中提出的DPV-ANN模型明顯優(yōu)于基于近紅外結(jié)合偏最小二乘的預(yù)測模型，并且具有更高的精度，消除了復(fù)雜的樣品預(yù)處理或電極修飾過程。這不僅節(jié)省了成本，而且提高了檢測效率。不同尖銳度檢測方法的性能差異見表S8。
為了研究各個DP伏安特征對模型輸出的影響，分析了最優(yōu)模型的特征重要性，結(jié)果如圖4d所示。顏色越亮，對應(yīng)點對模型的貢獻越大。在0.34～0.52 V和1.0～1.2 V處有兩個相對明亮的波段，之前有報道稱PZB中多酚和烷基酰胺的峰電位都在這個范圍內(nèi)，這表明這兩種物質(zhì)與PZB中的辛辣強度密切相關(guān)。為了進一步驗證多酚特征對辣味強度評價模型的影響，將這些特征排除在外，并使用最優(yōu)超參數(shù)對模型進行重新訓(xùn)練。特征消融模型在測試集上的表現(xiàn)從R2＝0.918下降到R2＝0.831，這種下降清楚地說明了多酚成分對PZB刺激性強度的影響。去除這些相關(guān)特征降低了模型捕捉多酚和辛辣之間復(fù)雜相互作用的能力，導(dǎo)致預(yù)測準(zhǔn)確性降低。
DPV法檢測刺鼻強度的機理
為了闡明DP伏安信號快速量化PZB刺鼻強度的機理，分析了主要刺鼻物質(zhì)羥基-α、β和γ-山椒素（α、β、γ-SOH）的伏安特性與刺鼻強度的關(guān)系。如圖5a～c所示，三種SOHs的陽極峰電位分別為0.93、0.95和0.92 V。各SOH的峰值強度（Ip）與其濃度梯度呈良好的線性關(guān)系。此外，通過線性回歸定量分析了不同濃度SOH的峰電位（Ep）、峰面積（Ap）和峰值電位（Ip）與SPU之間的關(guān)系。
擬合方程為：SPU＝?630.75Ep＋662.60Ip＋694.86Ap＋737.40，R2＝0.952。
結(jié)果表明，SOH的辛辣強度與Ep呈負相關(guān)，與Ip呈正相關(guān)。已有文獻表明，SOH的麻木感主要歸因于瞬時受體電位香草素1（TRPV1）和TRP錨蛋白1（TRPA1）的刺激，α-SOH通過與特定半胱氨酸殘基的共價或非共價相互作用作用于TRPA1和TRPV1。由于TRPV1和TRPA1都是氧化還原生物傳感器，它們的刺激與氧化還原狀態(tài)密切相關(guān)，因此可以推測氧化電位較低（即Ep值較低）的SOH更容易被氧化，從而促進其與TRPV1或TRPA1的相互作用。這就解釋了為什么DP伏安圖能夠區(qū)分不同SOH的辛辣強度。
槲皮素DPV在0.26～0.43 V和0.96～1.2 V處出現(xiàn)了兩個陽極峰（圖5d），而IPF伏安圖在0.3、0.6和1.1 V處出現(xiàn)了三個陽極峰（圖5e），表明存在其他多酚。當(dāng)IPF與α-SOH復(fù)合后，0.26～0.43 V和0.42～0.71 V的峰值強度急劇下降。而α-SOH在1.1 V處的峰與α-SOH的特征峰相結(jié)合，峰強度顯著增加，Ep從α-SOH向外正移。IPF/α-SOH組合的DP伏安圖與S14等PZB樣品的DP伏安圖基本一致（圖5f），說明多酚與SOH之間的DPV信號相互作用在辣度預(yù)測中得到了很好的體現(xiàn)。此外，有研究表明，一些多酚激活TRPV1或TRPA1產(chǎn)生澀味，這也是一種三叉神經(jīng)感覺?？梢?，PZB中多酚與SOHs之間的意義重疊在DPV上得到了充分的反映。
這些發(fā)現(xiàn)表明，DPV結(jié)合機器學(xué)習(xí)算法能夠捕獲PZB中多酚和SOH的氧化還原特性，并模擬兩種成分之間的相互作用，從而實現(xiàn)對辛辣強度的精確測量。
Conclusion
開發(fā)一種快速可靠的方法來評估PZB的質(zhì)量對這種受歡迎的香料調(diào)味品的經(jīng)濟和聲譽完整性至關(guān)重要。在本研究中，將電化學(xué)分析與機器學(xué)習(xí)方法相結(jié)合，建立了一種快速檢測PZB地理真實性和緊急程度的方法，用于商業(yè)交易過程中的質(zhì)量監(jiān)測和深加工過程中的分級。鑒別PZB來源的準(zhǔn)確度為100%，鑒別PZB摻假的準(zhǔn)確度為97.9%。此外，KNN機器學(xué)習(xí)方法成功地區(qū)分了純PZB樣品和摻假樣品，即使在摻假減少20%的情況下，準(zhǔn)確率也達到87.4%。在平行實驗中，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對辣味強度的預(yù)測效果最好（R2＝0.918）。除烷基酰胺外，PZB中的多酚類物質(zhì)也可能對整體辛辣強度有貢獻，這為我們了解影響PZB感官屬性的因素提供了一個新的維度。因此，本研究強調(diào)了將電化學(xué)與機器學(xué)習(xí)方法相結(jié)合的潛力，為PZB的認證和分級提供了一種快速、可靠和創(chuàng)新的方法，其研究結(jié)果對食品工業(yè)具有有益的意義。
