新型冠狀病毒熒光PCR引物探針設(shè)計之我見（一）
新型冠狀病毒疫情爆發(fā)以后，早期診斷成為控制疫情的關(guān)鍵，而熒光PCR技術(shù)成為首選的初篩檢測手段。目前核酸檢測率只有30-40%，使得檢測試劑盒的靈敏度備受關(guān)注。本期推薦林鏡中博士從引物探針設(shè)計的角度對試劑盒靈敏度的分析，以饗讀者。
一、前言
新型冠狀病毒疫情爆發(fā)以后，早期診斷成為控制疫情的關(guān)鍵，而熒光PCR技術(shù)成為首選的初篩檢測手段。到目前為止已經(jīng)有數(shù)家企業(yè)獲得了新型冠狀病毒熒光PCR檢測試劑的臨床注冊批文，還有近百家企業(yè)開發(fā)了類似的產(chǎn)品。近期有諸多聲音反映現(xiàn)有的新型冠狀病毒熒光PCR檢測試劑盒靈敏度較低，目前檢出率只有30-40%，多次出現(xiàn)漏檢的情況。業(yè)界對此進行了廣泛的討論，一個共識是造成檢出率低，假陰性率高有很多原因，包括試劑盒的靈敏度、試劑盒原材料的質(zhì)量、核酸提取的效率、儀器設(shè)備的質(zhì)量、操作誤差等，但是對試劑盒的靈敏度低的原因沒有系統(tǒng)的分析。筆者認為，引物探針設(shè)計是決定試劑靈敏度的關(guān)鍵，設(shè)計上存在的問題是內(nèi)在缺陷，很難通過優(yōu)化試劑盒組分和調(diào)整實驗條件來得到顯著改善。
早期診斷的靈敏度事關(guān)新型冠狀病毒疫情防控的成敗，同時今后將有一大批企業(yè)申報該產(chǎn)品的注冊批文，最終推向檢測市場，對人民健康產(chǎn)生深遠的影響。疫情爆發(fā)后，世界衛(wèi)生組織（WHO）發(fā)表了多個國家設(shè)計的新型冠狀病毒熒光PCR引物探針序列。筆者常年從事分子檢測試劑的研究開發(fā)，特別是熒光PCR技術(shù)。新型冠狀病毒疫情爆發(fā)后，我們也進行了相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)，我們發(fā)現(xiàn)WHO發(fā)布的來自不同國家的引物探針設(shè)計，有些存在比較明顯的缺陷。本文以美國CDC設(shè)計的N基因引物探針為例，論述Taqman熒光PCR引物和探針設(shè)計的基本原則，并提出一些建議，供同行們參考，避免走彎路，浪費資源，也算是為抗擊疫情盡一份力量。
任何技術(shù)都有優(yōu)缺點，站在不同的角度，側(cè)重點不一樣，或者使用的參數(shù)或算法或軟件不一樣，結(jié)論也可能各有所異。理論分析畢竟與臨床樣本檢驗的結(jié)果不可同日而語。產(chǎn)品的靈敏度最終都得經(jīng)過臨床試驗，達到注冊檢驗要求為標準。文中觀點難免偏頗，歡迎批評指正。
二、Taqman探針法熒光PCR的基本原理
實時熒光PCR是一種實時監(jiān)控特定核酸目標序列PCR擴增的技術(shù)。Taqman探針法是實時熒光PCR中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)。它的基本原理是在反應(yīng)中加入一對特異的引物及一條經(jīng)熒光標記的Taqman探針，探針的5’端用報告熒光基團標記，3’端用淬滅熒光基團標記。在探針完整時，由于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）的作用，報告基團的熒光被淬滅基團吸收發(fā)出不同于儀器收集波長的熒光，不能檢測到擴增信號，因此探針必須依賴Taq酶的5’-3’的外切活性，在引物結(jié)合到模板后隨著合成雙鏈的進程，將已經(jīng)與模板結(jié)合成雙鏈的探針切割，使報告熒光基團脫離淬滅基團的屏蔽而發(fā)出儀器應(yīng)檢測的熒光信號。常用的報告基團包括HEX、FAM、ROX、JOE、VIC等，淬滅基團包括TAMRA、BHQ等。
三、Taqman探針法熒光PCR引物探針的設(shè)計
一些最基本的原則可以參考美國ABI（賽默飛）的PrimerExpress 3.0指南（表1）。
表1：Taqman熒光PCR探針和引物設(shè)計指南（PrimerExpress 3.0, ABI）
根據(jù)我們的經(jīng)驗，最重要的參數(shù)包括引物探針的位置、Tm值、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、二聚體。以下以WHO發(fā)表的美國CDC的N基因引物探針（表2）為例加以詳細論述。
表2：?美國CDC設(shè)計的引物探針序列
