大鼠糖化血紅蛋白(HbA1c)ELISA檢測(cè)法
大鼠糖化血紅蛋白(HbA1c)ELISA試劑盒
?(用于血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清液和其它生物體液內(nèi))
?
原理
本實(shí)驗(yàn)采用雙抗體夾心?ABC-ELISA法。用抗大鼠?HbA1c?單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的?HbA1c與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗大鼠HbA1c，形成免疫復(fù)合物連接在板上，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Streptavidin與生物素結(jié)合，加入底物工作液顯藍(lán)色，最后加終止液硫酸，在450nm處測(cè)OD值，HbA1c濃度與OD值成正比，可通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中HbA1c濃度。
試劑盒組成（2-8℃保存）
酶標(biāo)板（Coated Wells） | 96孔 | 酶標(biāo)抗體工作液（Enzyme Conjugate） | 12ml |
10×標(biāo)本稀釋液（Sample Buffer） | 12ml | 20×濃縮洗滌液（Wash Buffer） | 50ml |
標(biāo)準(zhǔn)品（Standards）：2000%/瓶 | 2瓶 | 底物工作液（TMB Solution） | 12ml |
第一抗體工作液（Biotinylated Antibody） | 12ml | 終止液（Stop Solution） | 12ml |
準(zhǔn)備試劑與收集血樣
1.??????????收集標(biāo)本：血清、血漿（EDTA）、細(xì)胞培養(yǎng)上清液、組織勻漿等盡早檢測(cè)，2-8℃保存48小時(shí)；更長(zhǎng)時(shí)間須冷凍（-20?℃或-70?℃）保存，避免反復(fù)凍融。血清測(cè)定前用標(biāo)本稀釋液作1：20倍稀釋。
2.??????????標(biāo)準(zhǔn)品液配制：使用前加入1ml蒸餾水混勻，配成2000%的溶液。設(shè)標(biāo)準(zhǔn)管8管，第一管加標(biāo)本稀釋液900ul，第二至第八管加入標(biāo)本稀釋液500ul。在第一管中加入2000%的標(biāo)準(zhǔn)品溶液100ul混勻后用加樣器吸出500ul，移至第二管。如此反復(fù)作對(duì)倍稀釋，從第七管中吸出500ul棄去。第八管為空白對(duì)照。
3.??????????10×標(biāo)本稀釋液用蒸餾水作1:10倍稀釋（示例：1ml濃稀釋液+9ml蒸餾水）。
4.?????????洗滌液：用重蒸水1:20稀釋（示例：1ml濃縮洗滌液加入19ml的重蒸水）
檢測(cè)程序
1.??????????加樣：每孔各加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100ul，將反應(yīng)板充分混勻后置37℃120分鐘。
2.??????????洗板：用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4-6次，向?yàn)V紙上印干。
3.??????????每孔中加入第一抗體工作液100ul。將反應(yīng)板充分混勻后置37℃60分鐘。
4.??????????洗板：同前。
5.??????????每孔加酶標(biāo)抗體工作液100ul。將反應(yīng)板置37℃30分鐘。
6.??????????洗板：同前。
7.??????????每孔加入底物工作液100ul，置37?℃暗處反應(yīng)15分鐘。
8.??????????每孔加入100ul終止液混勻。
9.??????????30分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)吸光值。
結(jié)果計(jì)算與判斷
1.??????????所有OD值都應(yīng)減除空白值后再行計(jì)算。
2.??????????以標(biāo)準(zhǔn)品200、100、50、25、12.5、6.25、3.12、0 %為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上作圖，畫(huà)出標(biāo)準(zhǔn)曲線。
3.??????????根據(jù)樣品OD值在該曲線圖上查出相應(yīng)HbA1c含量即可。
試劑盒性能
?????????????1.???靈敏度：最小的HbA1c?檢測(cè)濃度小于1.5%。
2.????????特異性：可同時(shí)檢測(cè)重組或天然的大鼠HbA1c。不與大鼠其它細(xì)胞因子有交叉反應(yīng)。
3.????????重復(fù)性：板內(nèi)、板見(jiàn)變異系數(shù)均小于10％。
注意事項(xiàng)
?????????????1.???以上標(biāo)準(zhǔn)孔及待測(cè)樣品均建議做復(fù)孔，每次測(cè)定應(yīng)同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
?2.???洗滌過(guò)程很關(guān)鍵。洗滌不充分將導(dǎo)致精確度誤差及OD值錯(cuò)誤地升高。
?????????????3.???板條開(kāi)封后剩余板條要再封好，保持板條干燥。
?????????????4.???本試劑盒宜置4oC冰箱保存。
?5.???本試劑盒僅用于科研，不能用于臨床診斷！
-
焦點(diǎn)事件
