常用藥物鑒別法的分類及介紹
藥物鑒別采用的方法應是專屬性強、重現(xiàn)性好、靈敏度高并且操作簡便、快速。常用的鑒別方法有化學法、光譜法和色譜法。
一、化學鑒別法
化學鑒別法的特點:反應迅速、現(xiàn)象明顯、操作簡便、成本低廉。不要求是否反應完全,只要發(fā)生反應即可。
1.呈色反應鑒別法
呈色反應鑒別法是指供試品溶液中加入適當?shù)脑噭┤芤?在一定條件下進行反應,生成易于觀測的有色產(chǎn)物。在鑒別試驗中最為常用的呈色反應類型有以下幾個。
(1)三氯化鐵呈色反應:應用于含有酚羥基或水解后產(chǎn)生酚羥基的藥物,如水楊酸及其鹽。
(2)異羥肟酸鐵反應:應用于含有芳酸、芳酸酯或酰胺的藥物,如β-內(nèi)酰胺類。
(3)茚三酮呈色反應:應用于含有脂肪氨基的藥物,如氨基糖苷類。
(4)重氮化-偶合顯色反應:應用于含有芳伯氨基或能產(chǎn)生芳伯氨基的藥物,如奧沙西泮、貝諾酯。
(5)氧化還原顯色反應:應用于能與氧化劑或還原劑發(fā)生反應而顯色的藥物,如鹽酸氯丙嗪、腎上腺素。
(6)其他顏色反應:如維生素A。
2.沉淀生成反應鑒別法
沉淀生成反應鑒別法是指供試品溶液中加人適當?shù)脑噭┤芤?在一定條件下進行反應,生成不同顏色或特殊形狀的沉淀。
(1)與重金屬離子的沉淀反應:在一定條件下,藥物和重金屬離子反應,生成不同形式的沉淀,如巴比妥類藥物。
(2)與硫氰化鉻胺(雷氏鹽)的沉淀反應:應用于生物堿及其鹽或具有芳香環(huán)的有機堿及其鹽,如硫酸阿托品。
(3)其他沉淀反應:如維生素B1。
3.熒光反應鑒別法
常用的熒光發(fā)射形式有以下類型。
(1)藥物本身可在可見光下發(fā)射熒光。
(2)藥物溶液加硫酸使呈酸性后,在可見光下發(fā)射熒光,如苯并二氮雜類藥物。
(3)藥物和溴反應后,在可見光下發(fā)射熒光。
(4)藥物和間苯二酚反應后,發(fā)射出熒光或藥物經(jīng)其他反應后發(fā)射熒光。
4.氣體生成反應鑒別法
(1)大多數(shù)的胺(銨)類藥物、酰脲類藥物以及某些酰胺類藥物,可經(jīng)強堿處理后,加熱,產(chǎn)生氨氣,如普魯卡因。
(2)化學結構中含硫的藥物,可經(jīng)強酸處理后,加熱,產(chǎn)生硫化氫氣體。
(3)含碘有機藥物經(jīng)直火加熱,可生成紫色碘蒸氣,如苯佐卡因。
(4)含醋酸酯和乙酰胺類藥物,經(jīng)硫酸水解后,加乙醇可產(chǎn)生乙酸乙酯的香味。
5.使試劑褪色的鑒別法
如司可巴比妥鈉的碘試液反應。
6.測定生成物的熔點
如司可巴比妥鑒別項下要求“取本品1g,加水100mL溶解后,加稀醋酸5mL強力攪拌,再加水200mL,加熱煮沸使溶解成澄清溶液(液面無油狀物),放冷,靜置待析出結晶,濾過,結晶在70℃干燥后,依法測定,熔點約為97℃”。
二、光譜鑒別法
1.紫外-可見光譜鑒別法
多數(shù)有機藥物分子中含有能吸收紫外可見光的基團,從而顯示特征吸收光譜,這是紫外-可見光譜鑒別法的依據(jù)。鑒別時一般采用對比法,按規(guī)定的方法配制供試品溶液與對照品溶液,通過對比吸收光譜的特征數(shù)據(jù)、吸收度或吸收系數(shù)、吸收光譜的一致性等進行鑒別。由于紫外-可見吸收光譜比較簡單,光譜的曲線形狀變化不大,專屬性不如紅外光譜,同一物質圖譜相同,但圖譜相同的卻不一定為同一物質。但由于紫外-可見分光光度法比較方便,所以制劑的鑒別一般不采用紅外分光光度法,而采用紫外-可見分光光度法。
紫外-可見分光光度法應用時,主要有以下幾種方式。
(1)規(guī)定波長處最大或最小吸收,一般是特征吸收波長位置(λmax或λmin)。
如鹽酸偽麻黃堿鑒別項下要求“取本品,加水制成每1mL中含0.5mg的溶液,照紫外-可見分光光度法測定,在251nm、267nm與263nm的波長處有最大吸收”。
如芬布芬鑒別項下要求“取本品,加無水乙醇制成每1mL中約含5μg的溶液,照紫外-可見分光光度法測定,在281nm的波長處有最大吸收,在238nm的波長處有最小吸收”。
(2)測定一定濃度的供試液在最大吸收波長處的吸光度。
如棕櫚氯霉素鑒別項下要求“取本品,加無水乙醇溶解并定量稀釋制成每1mL中含20μg的溶液,照紫外-可見分光光度法測定,在271nm波長處有最大吸收,其吸光度約為0.35”。
(3)吸收系數(shù)法:測定吸收波長,計算吸收系數(shù)。
如氫化可的松性狀項下要求“取本品,精密稱定,加無水乙醇溶解并定量稀釋制成每1m.中約含10μg的溶液,照紫外-可見分光光度法,在242mm的波長處測定吸光度,吸收系數(shù)為422～448”。
(4)吸光度比值法:測定不同波長處的吸光度,比值在一定范圍內(nèi)。可以是吸收峰與吸收峰的比值,也可以是吸收峰與吸收谷的比值。
如丙酸倍氯米松鑒別項下要求“取本品,精密稱定,加乙醇溶解并定量稀釋制成每1mL中約含20μg的溶液,照紫外-可見分光光度法測定,在239nm的波長處有最大吸收,吸光度為0.57～0.60;在239nm與263nm的波長處的吸光度比值應為2.25～2.45”。
(5)樣品經(jīng)化學處理后,測定反應生成物的吸收光譜特性。
以上方法可以單個應用,為了提高鑒別的專屬性,也可以幾種方法結合起來使用,如丙酸倍氯米松的鑒別。
2.紅外光譜鑒別法
紅外光譜鑒別法是一種專屬性很強、應用廣泛的方法,主要用于組分單一、結構明確的原料藥,特別是結構復雜、用其他常用方法不易區(qū)分的藥物,并且適用于固體、液體甚至是氣體的樣品鑒別。
應用紅外光譜進行鑒別試驗時,藥典采用標準圖譜對照法。在藥典規(guī)定的條件下測定供試品的圖譜,然后與國家藥典委員會編訂的《藥品紅外光譜集》對照。
《藥品紅外光譜集》分卷出版,分別為第一卷(1995年出版)、第二卷(2000年出版)、第三卷(2005年出版)、第四卷(2010年出版)。每次新版中收載的藥品紅外光譜圖包括新增品種和老品種重新繪制的圖譜。所以,如果同一化合物的圖譜在不同卷上均有收載時,用于鑒別時以后卷圖譜作為比對依據(jù),前卷光譜圖僅作為參考。光譜圖中的橫坐標為波數(shù)(cm-1),縱坐標為透光率(T%)分辨率為2cm-1,基線一般控制在90%透光率以上,供試品取量一般控制在使其最強吸收峰在10%透光率以下。
原料藥的鑒別除另有規(guī)定外,應按照《藥品紅外光譜集》各卷收載的各光譜圖所規(guī)定方法制備樣品。常用的制備方法有壓片法、糊法、膜法、溶液法、衰減全反射法和氣體法等。
組成相對穩(wěn)定的多組分原料藥鑒別不能采用全光譜比對,需參照原料藥的標準光譜,在指紋區(qū)內(nèi)選擇主要成分的若干個特征譜帶作為鑒別的依據(jù)。
制劑鑒別應按品種鑒別項下規(guī)定的前處理方法處理,通常是采用溶劑提取法。提取時應選擇適宜的溶劑,盡可能減小輔料對鑒別結果的干擾,并且避免導致提取過程中藥物晶型的轉變。提取后的樣品經(jīng)適當干燥后依法進行鑒別。
在比對光譜時應注意以下兒點。
(1)輔料無干擾,待測成分的晶型不變化時,可直接與原料藥的標準光譜進行比對。
(2)輔料無干擾,而待測成分的晶型有變化時,可用對照品經(jīng)同法處理后的光譜比對。
(3)待測成分的晶型不變化,而輔料存在不同程度的干擾時,可參照原料藥的標準光譜,在指紋區(qū)內(nèi)選擇3~5個不受輔料干擾的待測成分的特征譜帶作為鑒別的依據(jù)。鑒別時,實測譜帶的波數(shù)誤差應小于規(guī)定值的0.5%。
(4)待測成分的晶型有變化,輔料也存在干擾,此種情況一般不宜采用紅外光譜鑒別。
對照時一般先看最強峰的吸收位置、形狀、數(shù)目等是否一致,然后再檢查中等強度峰和弱吸收峰是否對應,如果供試品的紅外光吸收圖譜與對照品的圖譜完全一致,一般可認為是同一種化合物(只有少數(shù)例外,如有些光學異構體或大分子同系物等)。若兩光譜圖不同,則可判定兩化合物不同。但是在實際操作中由于繪制圖譜時受藥物粉末細度、吸水程度、試樣的處理和制備等多種外界條件的影響較大,圖譜易發(fā)生變異,因此在圖譜對照時,要充分考慮各種因素可能造成的影響。
藥典一般不單獨用本法進行鑒別,常與其他理化方法聯(lián)合進行鑒別。
如硫酸阿托品鑒別項下規(guī)定:①本品(試樣制備:KBr壓片法)的紅外光吸收圖譜應與對照的圖譜(《藥品紅外光譜集》一致;②本品顯托烷生物堿類的鑒別反應;③本品的水溶液顯硫酸鹽的鑒別反應。
三、色譜鑒別法
色譜鑒別法是指利用不同物質在不同的色譜條件下,比移值(Rf)或保留時間(tR)等是否一致來判定樣品是否符合標準。因此,色譜法可用于多組分中的藥物鑒別。
1.薄層色譜鑒別法
薄層色譜法鑒別原理為同一種藥物在同樣條件下的薄層色行為相同。一般采用對照品(或標準品)比較法,將供試品和對照品(或標準品)按藥典規(guī)定,用同種溶劑配成同樣濃度的溶液。在同一層板上點樣、展開、顯色,要求供試品斑點應與對照品(或標準品)斑點的位置(Rf)和顏色一致。薄層色譜法簡單易行,適用于鑒別藥物及其制劑的真?zhèn)?其應用范圍日益擴大,特別是高效薄層色譜應用于中藥鑒別方面。
在薄層色譜鑒別時需注意,點樣基線距底邊10～15mm,高效板一般基線離底邊8～10mm。點樣時小心,不要損傷薄層表面;點樣的直徑一般不大于3mm,高效板一般不大于2mm;點間距離可視斑點擴散情況調整,并保證相鄰斑點互不干擾,一般不少于8mm,高效板供試品間隔不少于5mm。展開前如果需要溶劑蒸氣預平衡,可在展開缸中加入適量的展開劑,密閉保持15～30min。溶劑蒸氣預平衡后,迅速將點好供試品的薄層板放入展開缸中,進入展開劑的深度為距原點5mm為宜,展開劑不得沒過原點,密閉,靜置。除另有規(guī)定外,一般上行展開8～15cm,高效薄層板上行展開5～8cm。溶劑前沿達到規(guī)定的展距,取出薄層板,晾干,待檢測。
供試品顯色的方法:①含有可見光下有顏色的成分可直接在日光下檢視,也可用噴霧法或浸漬法以適宜的顯色劑顯色,或加熱顯色,在日光下檢視。②有熒光的物質或遇某些試劑可激發(fā)熒光的物質可在365nm紫外光燈下觀察熒光色譜。③對于可見光下無色、但在紫外光下有吸收的成分可川熒光薄層板(如硅膠GF254板)檢測,硅膠GF254板是在硅膠中摻入了少量熒光物質面制成的板,在254nm紫外燈下,整個薄層板呈黃綠色熒光,被測物質由于熒光猝火作用而呈現(xiàn)暗斑。
如葡萄糖酸鈣鑒別項下要求“取本品50mg,加水5mL,溫水浴溶解,濾過,取濾液作為供試品溶液。另取葡萄糖酸鈣對照品,同法制成每1mL中含10mg的溶液,作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗,吸取上述兩種溶液各5μL,分別點于同一硅膠G薄層板上,以乙醇-水-濃氨溶液-乙酸乙酯(50:30:10:10)為展開劑,展開,晾干,置110℃加熱20min后,放冷,噴以鉬酸銨-硫酸鈰試液(取鉬酸銨2.5g,加1mol/L硫酸溶液50mL使溶解,再加硫酸鈰1.0g,加1mol/L硫酸溶解并稀釋至100mL,搖勻),再在110℃加熱10min后,取出放冷,10min后檢視。供試品溶液所顯主斑點的位置和顏色應與對照品溶液的主斑點相同”。
2.高效液相色譜和氣相色譜鑒別法
一般規(guī)定按供試品含量測定項下的高效液相色譜條件進行試驗,要求供試品和對照品色譜峰的保留時間(tR)一致。含量測定方法為內(nèi)標法時,要求供試品溶液和對照品溶液色譜圖中藥物峰的保留時間與內(nèi)標物的保留試劑比值應相同。高效液相色譜和氣相色譜鑒別法操作比較復雜,耗時長,一般在檢查或含量測定項下已采用色譜法的情況下,才采用這兩種方法做鑒別。
如紫杉醇鑒別項下要求“在含量測定項下的色譜圖中,供試品溶液主峰的保留時間應與對照品溶液主峰的保留時間一致”。含量測定項下規(guī)定“取本品約12mg,精密稱定,置100mL量瓶中,加乙腈溶解并稀釋至刻度,搖勻,精密量取10μL注入液相色譜儀,記錄色譜圖;另取紫杉醇對照品,同法測定。按外標法以峰面積計算,即得”。
