多酶恒溫核酸快速擴增技術(shù)MIRPA的引物與探針設(shè)計指導
近期,頂級學術(shù)期刊連發(fā)兩篇頂級論文，上半年引爆生物圈的華人科學家張鋒教授團隊又有新動作!這次,他在一月內(nèi),分別在《Nature》、《Science》連發(fā)兩篇論文!他將CRISPR-Cas13a改造成了靈敏度達到了阿摩爾級(aM,10的負18次方摩爾每升),可以檢測單分子的SHERLOCK技術(shù)。而這其中,RPA起到了不小的作用。
RPA,即重組酶聚合酶擴增技術(shù),是在由多種酶和蛋白的參與下,在恒溫條件下實現(xiàn)核酸指數(shù)擴增的技術(shù),被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術(shù)。是英國TwistDx公司開發(fā)的，該公司通過突破等溫DNA擴增，開發(fā)的重組酶聚合酶擴增ZL技術(shù)（RPA），被譽為DNA診斷領(lǐng)域的革命性創(chuàng)新。
安普未來生物科技有限公司經(jīng)過十年技術(shù)沉淀，以代表未來技術(shù)趨勢的多酶恒溫快速擴增技術(shù)，MIRA（Multienzyme Isothermal Rapid Amplification, MIRA）。
MIRA（Multienzyme Isothermal Rapid Amplification, MIRA）技術(shù)是一種多酶恒溫核酸快速擴增技術(shù)，
基本原理是：在常溫恒溫下，重組酶和引物形成蛋白/單鏈核苷酸的復合體?Rec/ssDNA，在輔助蛋白和單鏈結(jié)合蛋白?SSB?的幫助下，侵入雙鏈?DNA?模板；在侵入位點形成?D-loop?區(qū)域，并開始對?DNA?雙鏈進行掃描；待找到與引物互補的目的區(qū)域后，復合體?Rec/ssDNA?解體的同時，聚合酶也結(jié)合到引物的?3’末端，開始鏈的延伸，這個過程迅速高效地循環(huán)，從而完成目的片段超快速擴增。
熒光檢測則依賴核酸外切酶的作用，加入根據(jù)模版設(shè)計的特異的分子探針，使用熒光監(jiān)測設(shè)備實現(xiàn)對目標片段擴增過程的實時監(jiān)控。
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圖?1：MIRA?技術(shù)原理圖示
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★引物設(shè)計
建議使用長度在?30-35bp?的引物，引物過長或過短會影響擴增速度和檢測靈敏度（特殊情況下設(shè)計較長
引物比較困難的序列，引物長度可縮短至?25 bp，但最好不少于?25 bp）；引物序列要求：
1.堿基排布隨機性高，GC?含量在?30%-70%之間；
2.擴增片段避免形成二級結(jié)構(gòu)而影響擴增；
3.擴增片段長度建議在?150-300 bp，通常不超過?500 bp。
★熒光探針設(shè)計
在上下游引物中間，設(shè)計一段長度為?46-52nt?與目的片段互補的序列作為熒光探針；探針序列不與特異
性引物識別位點重疊，長度為?46-52 nt，序列避免回文序列、內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)和連續(xù)的重復堿基。探針共有四
個修飾位點：
1.距離?5’端的?30-35 nt?的中部位置標記一個?dSpacer（四氫呋喃，THF），作為核酸外切酶的識別位點 （任
何堿基，無特殊要求） ；
2.THF?位點的上游的?T?堿基上標記一個熒光基團（如?FAM），下游在?T?堿基上標記一個淬滅基團（如
BHQ1），兩個基團的間距為?2-4 nt；
3.THF?距離?3’末端約?15 nt，并且?3’末端標記一個修飾基團，例如胺基、磷酸基團或?C3-spacer。
圖?2：MIRA?熒光探針圖示
4.探針示例：
探針序列：
5’-ATGGCTATCATATCGCATAACTGCCGACAGTAGCTCTCAAAGATGGACC-3’
??????????????? 30-35nt??????????????????????????????? ≥15nt
探針修飾：
ATGGCTATCATATCGCATAACTGCCGACAG[FAM-dT]AG[THF][BHQ-dT]CTCAAAGATGGACC-3’C3spacer。
