細(xì)胞凍存的操作要點(diǎn)（四）
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??低溫凍存技巧???
冷凍凝固的過程中，水分會(huì)在0℃~-20℃區(qū)間形成不同形狀的結(jié)晶
在細(xì)胞凍存時(shí)“降溫速度、冰晶形成量和細(xì)胞滲透壓改變程度”是凍存成功與否的重要關(guān)鍵。
降溫速度慢：冰晶由細(xì)胞外開始形成，造成胞外滲透壓變小，細(xì)胞內(nèi)水份移動(dòng)至細(xì)胞外造成細(xì)胞脫水。
降溫速度快：水分流動(dòng)時(shí)間短，細(xì)胞內(nèi)外滲透壓改變程度小，但大量水分留在細(xì)胞內(nèi)造成大量胞內(nèi)冰晶形成，使得胞器損壞。
這些都可能引起細(xì)胞損傷、凋亡或壞死，也可能造成復(fù)蘇后細(xì)胞存活率低、細(xì)胞形態(tài)改變、細(xì)胞功能喪失、基因變異等現(xiàn)象。
由此可知，最適合的凍存條件為“在增加細(xì)胞滲透壓穩(wěn)定性的溶液中，以慢到能減少胞內(nèi)冰晶形成，但也足夠快到能預(yù)防細(xì)胞脫水的降溫速度凍存細(xì)胞”。
慢凍快融
1. 慢凍→兩種辦法：
手動(dòng)降溫：將細(xì)胞依序放在4℃（30分鐘）、-20℃（1小時(shí)）、-80℃（過夜）后移至液氮中保存。
程序降溫盒：是一般最廣泛使用的降溫法，為一種特制冷凍容器，使細(xì)胞以每分鐘約-1℃的速度降至-80℃（過夜），然后移至液氮中保存。
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程序降溫 |
手動(dòng)降溫 |
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優(yōu)點(diǎn) |
主動(dòng)監(jiān)控溫度 一些控制速率的冷凍機(jī)不需要任何可消耗的制冷劑 |
不需要任何特殊器皿 成本低 |
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要求 |
受控速率凍結(jié)裝置 適當(dāng)?shù)拇鎯?chǔ)瓶 專門的冷凍溶液 |
專門的冷凍溶液 -80℃冷凍機(jī) 液氮罐 |
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長時(shí)間保存 |
液氮或低溫儲(chǔ)存（只要低于-135℃即可） |
液氮 |
由此可以看出，程序降溫精準(zhǔn)度更高，優(yōu)于手動(dòng)降溫。大家可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件選擇不同的凍存方式。
2. 快融：
將凍存在液氮中的細(xì)胞凍存管快速移至已37℃預(yù)熱的水浴鍋中（水面需低于管口，避免水分意外進(jìn)入凍存管造成潛在污染），使細(xì)胞冷凍懸液迅速融化；此做法能讓細(xì)胞冷凍懸液快速通過-20℃~0℃這個(gè)結(jié)晶形成溫度范圍，避免冰晶進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對(duì)細(xì)胞造成二次傷害。
FAQ
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問 題 |
建 議 |
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有毒的冷凍保存液 |
根據(jù)制造商的說明使用商業(yè)上可獲得的和定義的介質(zhì)。解凍后立即取出冷凍保護(hù)劑。避免細(xì)胞在室溫中置于低溫保護(hù)介質(zhì)中。 |
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不適當(dāng)?shù)睦鋮s速率 |
使用-1℃/min的逐漸冷卻速度。要達(dá)到這個(gè)速度，可以使用保溫的冷凍容器或控制速度的冷凍機(jī)。 |
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冷凍后的溫度變化 |
保持細(xì)胞在-130℃后的低溫。運(yùn)輸時(shí)要將細(xì)胞放在干冰上，并確保液氮中有充足的液氮。 |
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不當(dāng)?shù)慕鈨鏊俾?/strong> |
細(xì)胞必須迅速解凍，使用37℃的水浴解凍凍存管。 |
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不正確的細(xì)胞密度 |
根據(jù)不同的細(xì)胞類型選擇凍存的細(xì)胞密度。典型的細(xì)胞密度凍存密度是1-10*106cells/ml。 必要的話，要進(jìn)行細(xì)胞最佳凍存密度測(cè)試。 |
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Reference??
1. Ultralow storage temperatures suspend all molecular processes and prevents free radical generation that negatively effects cryopreserved cultures(Baust J., 2007; Baust, Corwin, Van Buskirk, & Baust, 2015).
2.? Mizrahi A, Moore GE, Appl Microbiol. 1970 Jun; 19(6):906-10 Merchant DJ, Hellman KB, Schneider H, Muirhead EE.
3.? Baust J., 2007; Van Buskirk, 2007; Baust, Corwin, Van Buskirk, & Baust, 2015; Allegrucci & Young.
4. Data Acknowledgment: Prof. Shirley H.J. Mei and research team Yuan Tan and Mahmoud Salkhordeh, Regenerative Medicine Program, Ottawa Hosptoal Research Institute(Ottawa, Canada).
