質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)組研究中的分析方法介紹
2003年人類基因組精細圖繪制完成，是人類科學(xué)史上一個里程碑式的事件。后基因組時代的研究重點自然落在了蛋白質(zhì)頭上。為啥？因為中心法則告訴我們，基因的產(chǎn)物——蛋白質(zhì)，是生命活動的最終執(zhí)行者。與基因組類比，研究生物體內(nèi)全套蛋白質(zhì)的科學(xué)，就是蛋白質(zhì)組學(xué)。基因組計劃完成的同年，人類蛋白質(zhì)組計劃啟動，令人激動的是，2014年人類蛋白質(zhì)組的草圖也完成了。而蛋白質(zhì)組學(xué)能夠飛速發(fā)展的最大功臣非質(zhì)譜莫屬。質(zhì)譜的應(yīng)用范圍非常廣泛，但這里只討論蛋白質(zhì)組學(xué)中的質(zhì)譜。
簡單地說，質(zhì)譜法（mass spectrometry）就是對肽段離子的重量（質(zhì)荷比，m/z）進行測量的分析方法。樣品經(jīng)質(zhì)譜儀（mass spectrometer）檢測得到質(zhì)譜圖（mass spectrum），通過對質(zhì)譜圖的分析就可以對樣品中的蛋白進行鑒定、定量。親，圖1的這種典型的蛋白質(zhì)組學(xué)流程都很熟悉吧。蛋白首先都要被特異性的酶（通常為Trypsin）切割為肽段，再進行后續(xù)分析，這在蛋白質(zhì)組學(xué)中被稱為“自下而上”的研究策略（Bottom-up proteomics）。我們平時見到的質(zhì)譜分析基本都是這種類型。提到蛋白質(zhì)組，即會聯(lián)想到一系列高大上的名詞，iTRAQ、SWATH、SILAC、Shotgun、Label-free等等。很多概念容易弄混淆，下面我們就來理理清楚。
圖1. 典型的蛋白質(zhì)組學(xué)流程
大體上，質(zhì)譜研究蛋白主要是鑒定和定量。通過二級質(zhì)譜圖（MS2或者MS/MS）進行數(shù)據(jù)庫搜索匹配鑒定蛋白。通過各種標(biāo)記或非標(biāo)記的手段對不同樣品中的蛋白進行比較就是定量。蛋白定量比較是質(zhì)譜最重要的用途，圖2是對定量方法的一個簡單總結(jié)。非標(biāo)定量（Label-free）不需要標(biāo)記，不同樣品分別處理、分別進質(zhì)譜檢測；優(yōu)點是處理簡單、無需標(biāo)記、價格便宜、可以比較很多組樣品，缺點是對操作步驟、LC、質(zhì)譜穩(wěn)定性要求嚴格。SILAC是在細胞培養(yǎng)基中加入穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸，在代謝水平標(biāo)記蛋白，一級質(zhì)譜圖進行定量，可以做到三組樣品混合后進行比較，定量準確，但是不能標(biāo)記組織樣本，養(yǎng)細胞成本也較貴。雙甲基化標(biāo)記是通過化學(xué)反應(yīng)的辦法在肽段水平進行標(biāo)記，一級質(zhì)譜定量，也可以三組對比，標(biāo)記試劑都比較便宜，而且可以標(biāo)記任何來源的樣品。iTRAQ和TMT是商品化的試劑盒，肽段水平標(biāo)記，二級質(zhì)譜定量；分別可以做到最多8組和10組樣品間蛋白質(zhì)組的比較。
圖2. 質(zhì)譜定量方法
以上這幾個是一家的，還有幾個名詞是屬于另外一家，比如Shotgun (DDA)、SWATH/DIA、SRM (MRM)、MRMHR/PRM。質(zhì)譜進行數(shù)據(jù)采集的方式大致分為三種：鳥槍法（Shotgun）、選擇反應(yīng)監(jiān)控（SRM）和全景式的SWATH/DIA。下面對照圖3再來簡單介紹一下。
圖3. 質(zhì)譜掃描方式
DDA、IDA、Shotgun和鳥槍法說的是相同的東西，意思是質(zhì)譜在每個循環(huán)的中從一級里挑選豐度高的TopN個肽段去打碎做二級掃描，得到的結(jié)果通過與已知數(shù)據(jù)庫中的理論蛋白進行匹配。DDA簡單有效，分析流程比較成熟，也是目前質(zhì)譜分析的主流方式。DDA也有其固有的缺陷，即具有一定的隨機性，偏向于檢測豐度較高的肽段，而抑制了低豐度肽段的檢測。
靶向策略被稱為質(zhì)譜領(lǐng)域的Western blot。質(zhì)譜只去采集目標(biāo)肽段大小的離子信息，因而提高了靈敏度和特異性。這種方法用來研究感興趣的特定蛋白，定量準確，但是通量很有限。
SWATH/DIA這種全景式的數(shù)據(jù)采集方式在最近幾年突然火了起來，被認為在不遠的未來可能會取代DDA的主流位置。該方法采取的策略是將掃描范圍內(nèi)的所有肽段按照質(zhì)荷比分為若干個窗口，再對每個窗口里所有的肽段一起打碎，采二級，數(shù)據(jù)分析時通過抽提蛋白的子離子信息進行定量。SWATH/DIA解決了DDA中隨機性選擇肽段的缺陷，所以重復(fù)性更好，定量的準確性基本達到了SRM的水平，而且可以實現(xiàn)大規(guī)模定量。
借用聽來的一個比喻來說明：DDA就像機關(guān)槍掃射，數(shù)量多、體積大的目標(biāo)命中的概率要大一些。靶向掃描（SRM或PRM）就像精準狙擊，排除干擾，目標(biāo)明確，每一槍直指目標(biāo)，但是難以大規(guī)模消滅敵人。SWATH/DIA就是地毯式轟炸，只要暴露在我方攻擊范圍內(nèi)的敵人，不管三七二十一，全部炸完。
圖4. 定量方法與采集方式結(jié)合
如果將上述的定量方法（圖2）和質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集方式（圖3）結(jié)合起來，就得到了現(xiàn)在基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)研究的各種策略（圖4）。再打個比方，保證吃貨們一聽就懂：雞、魚、肉、蛋、蔬菜要通過炒鍋、烤箱、高壓鍋、微波爐等烹調(diào)之后才能變?yōu)槊朗?，填飽肚子。同樣的，各種定量方法（非標(biāo)的和標(biāo)記的）處理的樣品，要通過質(zhì)譜各種采集方式變?yōu)殡娔X中的數(shù)據(jù)，才能分析并從中得到蛋白的信息。
本次的介紹就先到這里了，如果其中有什么問題，歡迎您批評和建議，我們會努力變得更好；如果需要跟我們進行技術(shù)交流和討論，歡迎大家聯(lián)系武漢金開瑞。后續(xù)我們還會繼續(xù)推出對質(zhì)譜技術(shù)各方面進行解析的文章，敬請期待。
References
A draft map of the human proteome. Nature 509: 575–581 (2014)
Mass-spectrometry-based draft of the human proteome. Nature 509: 582–587 (2014)
A review: Annu. Rev. Biochem. 80: 273–99 (2011)
SILAC: Molecular & Cellular Proteomics 1: 376-386 (2002)
iTRAQ: Molecular & Cellular Proteomics 343: 91–99 (2010)
SRM: Nature Methods 9: 555–566 (2012)
SWATH: Molecular & Cellular Proteomics 11: 1–17 (2012)
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