基因克隆常見方法
、T4連接酶介導(dǎo)的DNA克隆
傳統(tǒng)的分子克隆，通常需要使用相同的限制性內(nèi)切酶酶切載體和目的片段，使得載體和片段產(chǎn)生相同的粘性或平末端，使用T4 DNA連接酶對其進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化，挑取陽性克隆，得到重組質(zhì)粒
為了更方便的對DNA進(jìn)行克隆，后續(xù)又將克隆的載體進(jìn)行了簡化，出現(xiàn)了T載體，這樣就可以不用酶切，直接將片段連接到載體上，以便于DNA的保存及后續(xù)擴(kuò)增。
以TA克隆為例來介紹整個連接過程。常規(guī)的連接是一個三分子共同反應(yīng)的過程（圖1），載體、片段和連接酶碰撞在一起，發(fā)生反應(yīng)，完成連接過程。為了得到更多的陽性克隆，我們會傾向于加入更多的片段、載體和連接酶，以提高分子碰撞機(jī)率，但同時也會遇到一個問題，過高的DNA濃度和T4連接酶濃度會增加分子間相互作用促進(jìn)串聯(lián)體和載體自連的形成，反而導(dǎo)致片段和酶的利用率降低。所以在進(jìn)行TA克隆時，并不是DNA和酶加入的越多越好。
使用這種方法進(jìn)行克隆，如果需要連接平末端的DNA片段（比如Pfu類酶擴(kuò)增的片段），則需要進(jìn)行額外的加A尾反應(yīng)（可以使用Taq酶完成加A）
二、EASY克隆
EASY克隆的方法主要依賴于載體上所攜帶的拓?fù)洚悩?gòu)酶。拓?fù)洚悩?gòu)酶的生理作用主要體現(xiàn)在DNA復(fù)制的過程中，同時具有內(nèi)切酶和連接酶的功能：酶切釋放DNA復(fù)制過程中產(chǎn)生的螺旋力；在復(fù)制完成后，將缺口補(bǔ)上，完成DNA的復(fù)制。很多拓?fù)洚悩?gòu)酶無明顯特異性結(jié)合DNA序列的規(guī)律，直到1990年，科學(xué)家舒曼在牛痘病毒中發(fā)現(xiàn)了一種拓?fù)洚悩?gòu)酶能特異性識別C/TCCTT序列（圖2），并對后面序列進(jìn)行切割和連接，才使得拓?fù)洚悩?gòu)酶用于DNA克隆成為可能。
圖2 左圖：拓?fù)洚悩?gòu)酶識別特定的序列；右圖：拓?fù)洚悩?gòu)酶介導(dǎo)的基因克隆
EASY克隆就是基于這一原理，將T堿基通過磷酸鍵與拓?fù)洚悩?gòu)酶第274位酪氨酸結(jié)合，使拓?fù)洚悩?gòu)酶和載體偶聯(lián)在
