基因克隆的基本步驟有哪些
基因克隆的基本步驟流程如下：
一、目的DNA片段的獲得：
DNA克隆的第一步是獲得包含目的基因在內(nèi)的一群DNA分子，這些DNA分子或來自于目的生物基因組DNA或來自目的細胞mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成的雙鏈 cDNA分子。
由于基因組DNA較大，不利于克隆，因此有必要將其處理成適合克隆的DNA小片段，常用的方法有機械切割和核酸限制性內(nèi)切酶消化。若是基因序列已知而且比較小就可用人工化學(xué)直接合成。如果基因的兩端部分序列已知，根據(jù)已知序列設(shè)計引物，從基因組DNA 或cDNA中通過PCR技術(shù)可以獲得目的基因。
二、載體的選擇：
基因克隆常用的載體有：質(zhì)粒載體、噬菌體載體、柯斯質(zhì)粒載體、單鏈DNA噬菌體載體、噬粒載體及酵母人工染色體等。從總體上講，根據(jù)載體的使用目的，載體可以分為克隆載體、表達載體、測序載體、穿梭載體等。
三、體外重組：
體外重組即體外將目的片斷和載體分子連接的過程。大多數(shù)核酸限制性內(nèi)切酶能夠切割DNA分子形成有黏性末端，用同一種酶或同尾酶切割適當(dāng)載體的多克隆位點便可獲得相同的黏性末端，黏性末端彼此退火，通過T4?DNA連接酶的作用便可形成重組體，此為黏末端連接。
當(dāng)目的DNA片斷為平端，可以直接與帶有平端載體相連，此為平末端連接，但連接效率比黏端相連差些。有時為了不同的克隆目的，如將平端DNA分子插入到帶有黏末端的表達載體實現(xiàn)表達時，則要將平端DNA分子通過一些修飾；
如同聚物加尾，加銜接物或人工接頭，PCR法引入酶切位點等，可以獲得相應(yīng)的黏末端，然后進行連接，此為修飾黏末端連接。
四、導(dǎo)入受體細胞：
載體DNA分子上具有能被原核宿主細胞識別的復(fù)制起始位點，因此可以在原核細胞如大腸桿菌中復(fù)制，重組載體中的目的基因隨同載體一起被擴增，最終獲得大量同一的重組DNA分子。
五、重組子的篩選：
從不同的重組DNA分子獲得的轉(zhuǎn)化子中鑒定出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子即陽性克隆的過程就是篩選。發(fā)展起來的成熟篩選方法如下：
（1）插入失活法：外源DNA片段插入到位于篩選標記基因（抗生素基因或β-半乳糖苷酶基因）的多克隆位點后，會造成標記基因失活，表現(xiàn)出轉(zhuǎn)化子相應(yīng)的抗生素抗性消失或轉(zhuǎn)化子顏色改變，通過這些可以初步鑒定出轉(zhuǎn)化子是重組子或非重組子。常用的是β-半乳糖苷酶顯色法即藍白篩選法（白色菌落是重組質(zhì)粒）。
（2）PCR篩選和限制酶酶切法：提取轉(zhuǎn)化子中的重組DNA分子作模板，根據(jù)目的基因已知的兩端序列設(shè)計特異引物，通過PCR技術(shù)篩選陽性克隆。PCR法篩選出的陽性克隆，用限制性內(nèi)切酶酶切法進一步鑒定插入片段的大小。
（3）核酸分子雜交法：制備目的基因特異的核酸探針，通過核酸分子雜交法從眾多的轉(zhuǎn)化子中篩選目的克隆。目的基因特異的核酸探針可以是已獲得的部分目的基因片段,或目的基因表達蛋白的部分序列反推得到的一群寡聚核苷酸,或其它物種的同源基因。
（4）免疫學(xué)篩選法：獲得目的基因表達的蛋白抗體，就可以采用免疫學(xué)篩選法獲得目的基因克隆。這些抗體即可是從生物本身純化出目的基因表達蛋白抗體，也可從目的基因部分ORF片段克隆在表達載體中獲得表達蛋白的抗體。
