聚合酶鏈反應(yīng)[PCR]實(shí)驗(yàn)原理和操作步驟(2)
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?br>
了解聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）的基本原理及其影響因素，掌握PCR的基本操作過程。
[儀器]
PCR儀、臺(tái)式離心機(jī)、電泳儀、電泳槽、紫外檢測(cè)儀
[試劑]
1、引物：用去離子水配成10 μmol /μL。
2、Taq聚合酶
3、10×PCR反應(yīng)緩沖液（加鎂離子）
4、dNTPs：四種核苷酸混合物，濃度為10mM
5、模板：含有R基因片段的重組cDNA的質(zhì)粒
6、1%瓊脂糖凝膠
7、50 ×TAE電泳緩沖液(1000 mL)
Tris 242 g，Na2EDTA.2H2O 37.2 g， 溶于600 ml 去離子水中；加冰乙酸57.1 ml, 最后用去離子水定容至1000 mL。
8、6× 上樣緩沖液
0.25% 溴酚藍(lán)；0.25%二甲苯睛藍(lán)，30%甘油，溶于水中，4℃保存。
[實(shí)驗(yàn)步驟]
1、反應(yīng)混合液的配制：在一個(gè)0.5mlPCR管中加入下列成分：
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| 兩種引物（各） | 2μl |
| 10×PCR 緩沖液 | 10μl |
| dNTPs | 2μl |
| 模板 | 1μl |
| Taq酶 | 0.5μl |
| 去離子水 | 補(bǔ)至100μl |
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充分混勻，離心片刻，使液體沉至管底。
實(shí)際操作時(shí)，先根據(jù)所需進(jìn)行的反應(yīng)數(shù)，配制反應(yīng)混合物（按上述配方，不含模板）。每組進(jìn)行3 個(gè)反應(yīng)，需配制76微升反應(yīng)混合物，則按上述配方的4倍進(jìn)行配制。然后分裝于4個(gè)PCR管中，每管19微升。其中3管每管加入1微升模板，另一管加入1微升水，作為對(duì)照。
2、PCR反應(yīng)條件
循環(huán)1：94℃，3分鐘；循環(huán)2-31：94℃變性45s、52℃退火45s、72℃延伸1min；共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。
3、反應(yīng)結(jié)束后，取5微升反應(yīng)產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析，其余置4℃保存?zhèn)溆谩?br>
（1）用1 x TAE緩沖液配制瓊脂糖凝膠：在電子天平上準(zhǔn)確稱取瓊脂糖0.2g，倒入100 ml三角瓶，加入20 mL緩沖液。
（2）微波爐上加熱40S。
（3）待冷卻至60℃左右時(shí)，加入1μL溴化乙啶，搖勻。
（4）將凝膠倒入預(yù)先準(zhǔn)備好的制膠板上，插入梳子，待冷卻。
（5）取5微升PCR產(chǎn)物在１％瓊脂糖膠上電泳：80V，20min。
（6）取出凝膠，在紫外燈下觀察，記錄觀察結(jié)果?！?br>
3、PCR產(chǎn)物的純化
（1）向PCR產(chǎn)物中加入等體積的酚/氯仿/異戊醇（25：24：1，v/v），混勻；
（2）14 000 r/m 離心5min；
（3）取上清液，再加等體積的酚/氯仿/異戊醇（25：24：1，v/v），混勻；
（4）14 000 r/m離心15 min；
（5）取上清液，加入1/10體積的3M NaAc (pH5.2)和2.5倍體積的無水乙醇，混勻，-20℃放置2 h或過夜。
（6）4℃，14 000 r/m離心15 min，棄上清液；
（7）沉淀用70%乙醇洗滌1次；
（8）14 000 r/m離心10 min，棄上清，風(fēng)干。獲得純化的PCR產(chǎn)物。
[注意事項(xiàng)]
由于PCR靈敏度非常高，所以特別需要防止反應(yīng)混合物受到DNA的污染，因此在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意下列事項(xiàng)：
1、所有與PCR有關(guān)的試劑，只作PCR實(shí)驗(yàn)專用，不得挪作它用。
2、操作中使用的PCR管、離心管、吸頭等，只能一次性使用。
3、特別注意防止引物受到用同一引物擴(kuò)增的DNA的污染。所有試劑，包括引物，應(yīng)從母液中取一部分稀釋成工作液以供平常使用，避免污染母液。
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綜述
