實時熒光定量pcr儀的原理簡介
實時熒光定量pcr儀由熒光定量系統(tǒng)和計算機組成，用來監(jiān)測循環(huán)過程的熒光。與實時設備相連的計算機收集熒光數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)通過開發(fā)的實時分析軟件以圖表的形式顯示。原始數(shù)據(jù)被繪制成熒光強度相對于循環(huán)數(shù)的圖表。原始數(shù)據(jù)收集后可以開始分析。實時設備的軟件能使收集到的數(shù)據(jù)進行正?；幚韥韽浹a背景熒光的差異。正?；罂梢栽O定域值水平，這就是分析熒光數(shù)據(jù)的水平。
? ? 實時熒光定量pcr儀在普通PCR儀設計基礎上增加熒光信號激發(fā)和采集系統(tǒng)和計算機分析處理系統(tǒng)，形成了具有熒光定量PCR功能的儀器。其PCR擴增原理和普通PCR擴增原理相同，在PCR擴增時加入的引物是利用同位素、熒光素等進行標記，使用引物和熒光探針同時與模板特異性結(jié)合擴增。擴增的結(jié)果通過熒光信號采集系統(tǒng)實時采集信號連接輸送到計算機分析處理系統(tǒng)，得出量化的實時結(jié)果輸出。
? ? 實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR)/qRT-PCR，是指在PCR反應體系中加入熒光標記物，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過擴增曲線對未知模板進行定量分析的方法。一般用于mRNA轉(zhuǎn)錄水平的定量研究、不同樣本或基因組中DNA拷貝數(shù)的測定、基因芯片結(jié)果驗證、藥效分析等。
? ? 熒光定量檢測根據(jù)所使用的標記物不同可分為熒光探針和熒光染料。熒光探針又包括Beacon技術（分子信標技術，以美國人Tagyi為代表）、 TaqMan探針（以美國ABI公司為代表）和FRET技術（以羅氏公司為代表）等；熒光染料包括飽和熒光染料和非飽和熒光染料，非飽和熒光染料的典型代表就是現(xiàn)在最常用的SYBR GreenⅠ；飽和熒光染料有EvaGreen、LC Green等。 嵌合熒光染料法（SYBR GreenⅠ）
? ? SYBR Green I是熒光定量PCR最常用的DNA結(jié)合染料，與雙鏈DNA非特異性結(jié)合。在游離狀態(tài)下，SYBR Green I發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結(jié)合，其熒光增加1000倍。所以，一個反應發(fā)出的全部熒光信號與出線的雙鏈DNA量呈比列，且會隨擴增產(chǎn)物的增加而增加。 SYBR Green I熒光染料與DNA雙鏈的結(jié)合 雙鏈DNA結(jié)合染料的優(yōu)點：實驗設計簡單，僅需要2個引物，不需要設計探針，無需設計多個探針即可以快速檢驗多個基因，且能夠進行熔點曲線分析，檢驗擴增反應的特異性，低的初始成本，通用性好，因此國內(nèi)外在科研中使用比較普遍。 熒光探針法（Taqman 技術）：PCR擴增時，加入一對引物的同時再加入一個特異性的熒光探針。該探針為一直線型的寡核苷酸，兩端分別標記一個熒光報告基團和一個熒光淬滅基團，探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收，PCR 儀檢測不到熒光信號； PCR擴增時（在延伸階段），Taq 酶的 5' —— 3' 切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條 DNA 鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與 PCR 產(chǎn)物形成完全同步，這也是定量的基礎所在。
? ? 熒光定量PCR儀有單通道，雙通道和多通道之分。當只用一種熒光探針標記的時候，選用單通道；有多種熒光標記的時候使用多通道。單通道也可以檢測多熒光的標記和目的基因表達產(chǎn)物，因為一次只能檢測一種目的基因的擴增量，需多次擴增才能檢測完不同的目的基因片段的量。多通道利于做多重PCR，實現(xiàn)一次檢測多種目的基因的功能。
? ? 實時熒光定量PCR儀主要應用于臨床醫(yī)學檢測、生物醫(yī)藥研發(fā)、食品行業(yè)、科研院校等。
