細(xì)胞凋亡、細(xì)胞壞死和細(xì)胞焦亡如何鑒別？
細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法有很多，下面給大家介紹常用的形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法。
光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡
凋亡細(xì)胞的主要特征為核染色質(zhì)致密深染，形成致密質(zhì)塊，有時(shí)可碎裂。在HE染色的組織切片中細(xì)胞體積縮小，胞質(zhì)致密、嗜酸性染色增強(qiáng)，并可形成凋亡小體。在組織中凋亡細(xì)胞常以分散單個(gè)形式存在，凋亡細(xì)胞與周圍細(xì)胞分離，不引起炎癥反應(yīng)。
本方法簡(jiǎn)便易行，但在細(xì)胞密集的組織中對(duì)于改變不典型的細(xì)胞判斷較困難，常缺乏較為特征的指標(biāo)，具有較強(qiáng)的主觀性，重復(fù)性差。本方法可用于調(diào)亡現(xiàn)象的初步觀察，作為分析指標(biāo)之一。
未染色細(xì)胞：凋亡細(xì)胞的體積變小、變形，全面皺縮，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡晚期可見(jiàn)凋亡小體，凋亡小體為數(shù)個(gè)圓形小體圍繞在細(xì)胞周圍。貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。
染色細(xì)胞：姬姆薩（Giemsa）染色、瑞氏染色等。正常細(xì)胞核色澤均一；凋亡細(xì)胞染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)；壞死細(xì)胞染色淺或沒(méi)染上顏色。
蘇木素-伊紅（HE）染色：細(xì)胞核固縮碎裂、呈藍(lán)黑色、胞漿呈淡紅色（凋亡細(xì)胞），正常細(xì)胞核呈均勻淡藍(lán)色或藍(lán)色，壞死細(xì)胞核呈很淡的藍(lán)色或藍(lán)色消失。
熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡
一般以細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變?yōu)橹笜?biāo)來(lái)評(píng)判細(xì)胞凋亡的進(jìn)展情況。常用的DNA特異性染料有：Hoechst 33342， Hoechst 33258，DAPI。三種染料與DNA 的結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時(shí)發(fā)射明亮的藍(lán)色熒光。
Hoechst是與DNA特異結(jié)合的活性染料，能進(jìn)入正常細(xì)胞膜而對(duì)細(xì)胞沒(méi)有太大細(xì)胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度要比正常細(xì)胞中要高。DAPI為半通透性，用于常規(guī)固定細(xì)胞的染色。
PI和Hoechst33342雙標(biāo)：PI、Hoechst33342均可與細(xì)胞核DNA（或RNA）結(jié)合。但PI不能通過(guò)正常細(xì)胞膜，Hoechst則為膜通透性熒光染料，故細(xì)胞在處于壞死或晚期調(diào)亡時(shí)細(xì)胞膜被破壞，這時(shí)可為PI著紅色。
正常細(xì)胞和中早期調(diào)亡細(xì)胞均可被Hoechst著色，但是正常細(xì)胞核的Hoechst著色的形態(tài)呈圓形，淡蘭色，內(nèi)有較深的蘭色顆粒；而調(diào)亡細(xì)胞的核由于濃集而呈亮蘭色，或核呈分葉，碎片狀，邊集。故PI著色為壞死細(xì)胞；亮蘭色，或核呈分葉狀，邊集的Hoechst著色的為調(diào)亡細(xì)胞。
凋亡細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮。細(xì)胞凋亡過(guò)程中細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變分為三期：Ⅰ期的細(xì)胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased），部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)；Ⅱa期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；Ⅱb期的細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。
電子顯微鏡
雖然光學(xué)顯微鏡下可以看見(jiàn)胞膜起泡現(xiàn)象和凋亡小體,但凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化大多發(fā)生在超微結(jié)構(gòu),因此用光鏡觀察難以令人滿意,而透射電鏡可清楚地觀察到細(xì)胞結(jié)構(gòu)在凋亡不同時(shí)期的變化。電鏡形態(tài)學(xué)觀察是迄今為止判斷凋亡最經(jīng)典、最可靠的方法,被認(rèn)為是確定細(xì)胞凋亡的金標(biāo)準(zhǔn)。
檢測(cè)方法：透射電鏡標(biāo)本經(jīng)戊二醛和餓酸雙重固定，丙酮脫水，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，超薄切片，醋酸枸椽酸電子又重染色，透射電鏡觀察。掃描電鏡標(biāo)本經(jīng)戊二醛和餓酸雙重固定，乙醇逐級(jí)脫水，CO2臨界點(diǎn)干燥，真空噴金，掃描電鏡觀察。
結(jié)果評(píng)判: 可見(jiàn)凋亡細(xì)胞表面微絨毛消失，核染色質(zhì)固縮、邊集，常呈新月形，核膜皺褶，胞質(zhì)緊實(shí)，細(xì)胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小體和凋亡小體被臨近巨噬細(xì)胞吞噬現(xiàn)象。
缺點(diǎn)：
1）只能定性,不能定量;
2）標(biāo)本處理過(guò)程復(fù)雜,設(shè)備相對(duì)昂貴,對(duì)檢查者的技術(shù)水平要求較高,不適于大批標(biāo)本檢測(cè);
3）在組織切片上進(jìn)行電鏡觀察時(shí),有時(shí)凋亡很難與正常細(xì)胞有絲分裂相鑒別,因?yàn)閮煞N情況下都可出現(xiàn)染色質(zhì)濃聚。如同時(shí)進(jìn)行熒光染色,可彌補(bǔ)電鏡檢查的不足。
流式細(xì)胞技術(shù)
流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞是通過(guò)檢查其光射特征及熒光參數(shù)時(shí)行的。細(xì)胞穿過(guò)流式細(xì)胞儀的激光束集點(diǎn)時(shí)使激光發(fā)生散射，分析散射光可以提供細(xì)胞大小及結(jié)構(gòu)的信息。由于光散射牧場(chǎng)生并非凋亡細(xì)胞的特異性指標(biāo)，細(xì)胞的機(jī)械性損傷和細(xì)胞壞死也可以使前向散射光減弱。因此，只有將光散射特性的檢測(cè)與熒光參數(shù)的檢測(cè)結(jié)合起來(lái)才能準(zhǔn)確地辨認(rèn)凋亡細(xì)胞。
細(xì)胞凋亡過(guò)程中核酸內(nèi)切酶在DNA分子核小體間的降解，導(dǎo)致小分子DNA漏出，核DNA含量下降，細(xì)胞熒光染色后作流式細(xì)胞儀分析，可以發(fā)現(xiàn)在DNA直方圖上正常二倍體細(xì)胞的Go/G1峰前出現(xiàn)一個(gè)亞二倍體峰（xub-G1峰，即AP峰--apoptotic peak）,代表凋亡細(xì)胞。
如何鑒別細(xì)胞焦亡？
細(xì)胞焦亡的機(jī)制中GSDMD的切割，IL-1β和IL-18前體的切割成熟和釋放是關(guān)鍵信號(hào)，因此證明所誘發(fā)的細(xì)胞死亡方式是否為細(xì)胞焦亡，需要幾個(gè)關(guān)鍵的實(shí)驗(yàn)證據(jù)：
①GSDMD的切割（Western檢測(cè)）；
②Caspase的激活，主要是Caspase-1，Caspase-4，Caspase-5，Caspase-11（Western檢測(cè)）；
③IL-1β和IL-18前體的切割成熟和釋放（Western，ELISA等）；
④細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)（CCK-8等）；
⑤染色質(zhì)完整性檢測(cè)（Tunel等）。
完整檢測(cè)方式如下：
1、形態(tài)變化
①掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)；
②免疫熒光染色（GSDMD/GSDME）；
③Tunel檢測(cè)。
2、檢測(cè)焦亡相關(guān)基因及蛋白
①q-PCR/Western Blot方法檢測(cè)焦亡相關(guān)基因或蛋白的表達(dá)水平（例如，Caspase-1、4、5、11；GSDMD；Cleaved Caspase-3、IL-1β、IL-18、NLRP3、ASC等）；
②ELISA試劑盒檢測(cè)炎癥因子的水平；
③CCK8法測(cè)定細(xì)胞活力；
④免疫組化檢測(cè)組織蛋白的表達(dá)。
-
科技前沿
-
技術(shù)原理
