生物酶學(xué)基礎(chǔ)--酶的提取和分離純化
許多酶都存在于細胞內(nèi)。為了提取這些胞內(nèi)酶，首先需要對細胞進行破碎處理。細胞破碎的方法很多，主要包括機械破碎法、物理破碎法、化學(xué)破碎法和酶學(xué)破碎法等。機械破碎法是指利用搗碎機、研磨器或勻漿器等將細胞破碎開來。物理破碎法是指利用溫度差、壓力差或超聲波等將細胞破碎開來。化學(xué)破碎法是指利用甲醛、丙酮等有機溶劑或表面活性劑作用于細胞膜，使細胞膜的結(jié)構(gòu)遭到破壞或透性發(fā)生改變。酶學(xué)破碎法是指選用合適的酶，使細胞壁遭到破壞，進而在低滲溶液中將原生質(zhì)體破碎開來。
酶的提取是指在一定條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┨幚砑毎扑楹蟮暮冈?，使酶充分地溶解到提取液中的過程。酶的提取方法有鹽溶液提取法、堿溶液提取法和有機溶劑提取法等。為了提高酶的提取率和防止酶提取后變性失活，提取過程中必須注意保持適宜的溫度和pH，并且添加適量的保護劑。
提取液中含有多種酶，要想從提取液中分離純化出某一種酶，必須根據(jù)這種酶的特性，選擇適合的分離純化方法。酶分離純化的方法很多，下面簡介利用酶相對分子質(zhì)量的大小進行分離純化的過程。
首先，通過透析的方法，使提取液中的酶和其他蛋白質(zhì)分子與提取液中的各種小分子物質(zhì)分離開來。其次，通過高速離心使酶和其他蛋白質(zhì)分子沉降。在高速離心的情況下，酶和其他蛋白質(zhì)分子雖然都會發(fā)生沉降，但是沉降的速度因各自相對分子質(zhì)量的不同而不同。人們利用這一原理就可以達到分離純化酶的目的。具體做法是，取一只離心試管，管內(nèi)注入具有連續(xù)濃度梯度的蔗糖溶液（試管上部溶液的濃度低，下部溶液的濃度高）。在蔗糖溶液的表層，小心地滴上含有酶和其他蛋白質(zhì)的待分離純化的液體。
通過高速離心后，酶和其他蛋白質(zhì)就會沿著濃度梯度形成各自的區(qū)帶，每個區(qū)帶中只含有一種酶或一種蛋白質(zhì)。將離心試管的底部鉆一個小孔，使管內(nèi)的溶液分段流出。這樣就可以將各區(qū)帶的溶液分開，進而通過結(jié)晶和干燥等方法獲得所需要的那種酶。也可以將整個離心試管進行冷凍，然后通過切割獲得含有所需酶的那個區(qū)帶，進而通過結(jié)晶和干燥等方法獲得那種酶。
