凝膠層析法(凝膠過濾)脫鹽和分離蛋白質(zhì)-1
原理
凡鹽析所獲得的粗制蛋白質(zhì)（鹽析得到的IgG）中均含有硫酸銨等鹽類，這類將影響以后的純化，所以純化前均應(yīng)除去，此過程稱為“脫鹽”（desalthing）。脫鹽常用透析法和凝膠過濾法，這兩種方法各有利弊。前者的優(yōu)點(diǎn)是透析后析品終體積較小，但所需時間較長，且鹽不易除盡；凝膠過濾法則能將鹽除盡，所需時間也短，但其凝膠過濾后樣品體積較大。所以，要根據(jù)具體情況選擇使用。凝膠達(dá)濾后樣品體積不會太增加，所以選用凝膠過濾法。
凝膠過濾（gel filtration），又稱為凝膠層析（gel chromatography）、分子篩過濾（molecularsieve
filtration）、凝膠滲透層析（gel osmotic
chromatography）等。它是20世紀(jì)60年代發(fā)展起來的一種層析技術(shù)。其基本原理是利用被分離物質(zhì)分子大小不同及固定相（凝膠）具有分子篩的特點(diǎn)，將被分離物質(zhì)各成分按分子大小分開，達(dá)到分離的方法。
凝膠是由膠體粒子構(gòu)成的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。網(wǎng)眼里吸滿水后凝膠膨脹呈柔軟而富于彈性的半固體狀態(tài)。人工合成的凝膠網(wǎng)眼較均勻地分布在凝膠顆粒上有如篩眼，小于篩眼的物質(zhì)分子均可通過，大于篩眼的物質(zhì)分子則不能，故稱為“分子篩”。凝膠之所以能將不同分子的物質(zhì)分開是因?yàn)楫?dāng)被分離物質(zhì)的各成分通過凝膠時，小于篩眼的分子將完全滲入凝膠網(wǎng)眼，并隨著流動相的移動沿凝膠網(wǎng)眼孔道移動，從一個顆粒的網(wǎng)眼流出，又進(jìn)入另一顆粒的網(wǎng)眼，如此連續(xù)下去，直到流過整個凝膠柱為止，因而流程長、阻力大、流速慢；大于篩眼的分子則完全被篩眼排阻而不能進(jìn)入凝膠網(wǎng)眼，只能隨流動相沿凝膠顆粒的間隙流動，其流程短、阻力小、流速快，比小分子先流出層析柱；小分子最后流出。分子大小介于完全排阻不能進(jìn)入或完全滲入凝膠篩眼之間的物質(zhì)分子，則居中流出。這樣被分離物質(zhì)即被按分子的大小分開。
用于凝膠層析的凝膠均為人工合成的產(chǎn)品，主要有交聯(lián)葡聚糖（商品名為Sephadex）、瓊脂糖（商品名為Sepharose）、聚丙烯酰胺凝膠（商品名為Bio–gel）及具有一定網(wǎng)眼的細(xì)玻璃珠等和這些凝膠的衍生物。
下面主要介紹葡聚糖凝膠，這是由葡萄糖的多聚物與1–氯– 2、3–環(huán)氧丙烷交連而成。環(huán)氧丙烷引入丙三醇基將鏈狀的多聚葡萄糖單位交聯(lián)起來，凝膠網(wǎng)眼的大小由多聚葡萄糖的分子和環(huán)氧丙烷的比例（交聯(lián)度）來控制。
葡聚糖具有較強(qiáng)的親水性，在水和電解質(zhì)溶液中膨脹成為柔軟而富于彈性的凝膠，其吸水能力與葡聚糖凝膠的交聯(lián)度有密切關(guān)系。交聯(lián)度大的，孔徑小，吸水少，膨脹的程度小；交聯(lián)度小的，孔徑大，吸水多，膨脹的程度大。因此，葡聚糖凝膠孔徑的大小可以其吸水量的大小來表示，常以G–10至G–200號碼標(biāo)記。G后面的數(shù)字是其吸水量（毫升水/克干膠）乘以10所得的值。如G–25即表示吸水量為2.5ml/2干膠。市售有G–10、G–5、G–50、G–75、G–100、G–150、G–200等型號。G–75以上的膠因吸水量大，膨脹后形態(tài)柔軟易變，統(tǒng)稱為軟膠。G–75以下的稱為硬膠。
葡聚糖凝膠可分離的分子大小從幾百到數(shù)十萬。可根據(jù)被分離物質(zhì)的分子大小及目的選擇使用。一般說Sephadex G–l0～15通常用于分離肽及“脫鹽”。Sephadex G–75～200用以分離各類蛋白質(zhì)。
凝膠層析是一種物理分離法。葡聚糖凝膠基本上不帶電荷呈多惰性，不與被分離物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，所以分離的效果較好。然而由于它是葡萄糖的聚合物，因而仍有少量活性羥基，能吸附少量蛋白質(zhì)等被分離的物質(zhì)。為了克服這個缺點(diǎn)，一般使用含有離子強(qiáng)度達(dá)0.08的NaCl等中性鹽緩沖液作洗脫液。
操作方法
（1）取層析柱1支（1.5cm×20cm），垂直固定在支架上，關(guān)閉下端出口。將已經(jīng)溶脹好的Sephadex
G-25中的水傾倒出去，加入2倍體積的0.0175mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖液，并攪拌成懸浮液，然后灌注入柱，打開柱的下端出口，繼續(xù)加入攪勻的Sephadex
G-25，使凝膠自然沉降高度到17cm左右，關(guān)閉出口。待凝膠柱形成后，在洗脫瓶中加入0.0175mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖液以3倍柱體積的磷酸鹽緩沖流過凝膠柱，以平衡凝膠。
（2）凝膠平衡后，用皮頭滴管除去凝膠柱面的溶液，將鹽析所得全部IgG樣品加到凝膠柱表面，打開柱下口，控制流速讓IgG樣品溶液慢慢浸入凝膠內(nèi)。凝膠柱面上加一層的0.0175mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖液，并用此緩沖液洗脫，控制流速為0.5ml/min左右。用試管收集洗脫液，每管10滴。
