基因克隆技術(shù)概述
基因克隆技術(shù)是分子生物學(xué)的核心技術(shù)，其目的是獲得某一基因或DNA片段的大量拷貝，用于深入分析基因的結(jié)構(gòu)與功能，并可達(dá)到人為改造細(xì)胞以及物種遺傳性狀的目的?；蚩寺〉囊豁?xiàng)關(guān)鍵技術(shù)是DNA重組技術(shù)，它利用酶學(xué)方法將不同來源的DNA分子進(jìn)行體外特異性切割，重新拼接組裝成一個(gè)新的雜合DNA分子。在此基礎(chǔ)上將雜合DNA分子轉(zhuǎn)入一定宿主細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增，形成大量的子代分子，此過程稱基因克隆。有目的地通過基因克隆技術(shù)，人為操作改造基因，改變生物遺傳性狀的系列過程總稱為基因工程。
基因克隆的一般程序?yàn)椋?br>
一、獲取目的基因
目的基因就是需要研究的特定基因或DNA片段。獲取目的基因的主要方法：
1、用限制性內(nèi)切酶酶解染色體DNA，構(gòu)建基因組文庫，再從基因組文庫中篩選目的基因。該法的優(yōu)點(diǎn)是獲得的目的基因的組織結(jié)構(gòu)與天然基因完全相同，在結(jié)構(gòu)基因中也含有內(nèi)含子序列，但是也正因?yàn)檫@一點(diǎn)構(gòu)成了該法最大缺點(diǎn)，即含有內(nèi)含子的基因在原核細(xì)胞中不能表達(dá)。原因是原核細(xì)胞不能識(shí)別并剪切插入順序(內(nèi)含子)，因而也不能表達(dá)出正確的基因產(chǎn)物。
2、分離純化細(xì)胞中的mRNA，以mRNA為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶作用下生成cDNA第一鏈，再以cDNA第一鏈為模板在DNA聚合酶作用下生成雙鏈cDNA,構(gòu)建cDNA文庫，從中篩選所需的目的基因。此法僅用于篩選為蛋白質(zhì)編碼的結(jié)構(gòu)基因。因成熟的mRNA分子中已經(jīng)切除了內(nèi)含子序列，具有完整的閱讀框架，可在原核細(xì)胞中正確表達(dá)。
3、人工體外合成基因：由于當(dāng)前人工體外合成DNA的長(zhǎng)度有限，此法僅用于制備小分子生物活性多肽基因和小分子量蛋白基因。在基因較大情況下，常需先合成多個(gè)DNA片段，然后拼接成完整的基因，此法還要求目的基因的全部堿基順序已被闡明。
4、PCR法擴(kuò)增基因：PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展，為目的基因的尋找提供了有力技術(shù)工具。用PCR法可選擇性擴(kuò)增基因組中所要研究的個(gè)別基因或DNA片段，或用反向PCR技術(shù)，先將特定mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈，然后再進(jìn)行擴(kuò)增。用PCR法篩選基因，需要對(duì)目的基因的DNA序列至少有部分了解。
二、選擇適當(dāng)?shù)妮d體
按上述方法制備的目的基因如果沒有合適的載體協(xié)助，很難進(jìn)入受體細(xì)胞，即使能進(jìn)入，往往也不能進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)，因?yàn)檫@些外源性DNA一般不帶有復(fù)制調(diào)控系統(tǒng)。為了保證目的基因或外源DNA片段能在細(xì)胞內(nèi)克隆，必須將它們與適當(dāng)?shù)妮d體連接。理想的載體應(yīng)該是：(1)分子量較小，能在細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制的環(huán)狀或線狀DNA分子；(2)具有特異的限制性酶切位點(diǎn)，便于外源DNA片段的插入，且有明顯的遺傳篩選標(biāo)志，如抗藥性或插入失活等，以利于陽性克隆的篩選；(4)具有生物安全性。常用的克隆載體可分為三類，即質(zhì)粒、噬菌體及病毒。由于天然載體用于基因克隆存在許多缺點(diǎn)，現(xiàn)用載體實(shí)際上是在天然載體基礎(chǔ)上進(jìn)行改造而成。
1、質(zhì)粒載體
質(zhì)粒是細(xì)菌染色體外小型環(huán)狀DNA復(fù)制子，質(zhì)粒載體是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上人工改造拼接而成。質(zhì)粒載體具有如下特點(diǎn)：分子相對(duì)較小(3~10kb)；含松弛型復(fù)制子因而在宿主細(xì)胞的拷貝數(shù)高；在復(fù)制子外適當(dāng)位置有由多個(gè)單一內(nèi)切酶位點(diǎn)組成的多克隆區(qū)，極有利于外源DNA片段的插入；具有抗藥性及插入失活標(biāo)記，可以從平板中直接篩選陽性重組子。但由于質(zhì)粒分子太小，只能接受小于15kb的外源DNA片段的插入。因此，插入片段過大，會(huì)導(dǎo)致重組子擴(kuò)增速度減慢甚至插入片段丟失。
2、噬菌體載體
目前使用的噬菌體載體主要有λ噬菌體、Cosmid及M13噬菌體等。λ噬菌體是一種能感染大腸桿菌的病毒，其基因組為線狀雙鏈DNA分子。在λ噬菌體DNA(λDNA)的中間1/3處，是可被替換而不影響噬菌體生長(zhǎng)的“非生活區(qū)”，此區(qū)的DNA可通過遺傳工程技術(shù)由外來DNA片段所替代。λDNA作為載體的優(yōu)點(diǎn)是：在體外可包裝成病毒顆粒高效地感染大腸桿菌；載體容量大，可將23~25kb的外源DNA片段引入其內(nèi)；篩選和保存較為方便。
M13也是大腸桿菌噬菌體，其基因組為單鏈線性DNA分子。感染大腸桿菌后，此單鏈DNA轉(zhuǎn)變?yōu)閺?fù)制型雙鏈DNA?？寺?fù)制后，仍以單鏈形式包裝成新的噬菌體釋放到介質(zhì)中。M13DNA分子中有一長(zhǎng)507個(gè)核苷酸的小“非生活區(qū)”可以被外來DNA片段取代。M13載體的主要優(yōu)點(diǎn)是重組的M13DNA仍為單鏈結(jié)構(gòu)，所以能方便地用于Sanger雙脫氧法測(cè)定所克隆DNA片段的序列，或用于合成RNA探針的模板。M13載體的主要問題是容量太小，當(dāng)插入片段大于1000個(gè)核苷酸時(shí)就很不穩(wěn)定，容易在增殖的過程中丟失。
Cosmid載體從結(jié)構(gòu)上看成是一種人工構(gòu)建的雜種載體，由噬菌體DNA和質(zhì)粒DNA的某些功能片段拼接而成，其轉(zhuǎn)染細(xì)胞及病毒顆粒包裝與λDNA相似，但在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制則與質(zhì)粒相同。與λDNA相比，Cosmid的主要優(yōu)點(diǎn)是載體容量很大，插入DNA片段的長(zhǎng)度可高達(dá)45kb。
三、構(gòu)建重組體
DNA體外重組是將目的基因在DNA連接酶作用下，連接到合適的載體DNA上，以便下一步轉(zhuǎn)化之用。這種由兩種不同DNA片段重新組合而成的DNA稱重組DNA，簡(jiǎn)稱重組體。連接方式有粘端連接和平端連接等多種形式。（1）粘端連接：用相同的限制性內(nèi)切酶酶切目的基因和載體DNA分子，使之產(chǎn)生相同的粘性末端，在適當(dāng)?shù)臏囟认拢瑑煞NDNA分子的粘性末端互補(bǔ)配對(duì)，再用DNA連接酶共價(jià)連接，成為完整的重組體。由于粘端連接具有很高的重組效率，在實(shí)驗(yàn)中為首選方法。許多情況下，目的基因上找不到適當(dāng)?shù)呐c載體上相同的限制性酶切位點(diǎn)。此時(shí)可通過在目的基因兩端連上人工接頭(含適當(dāng)限制性酶切位點(diǎn)的合成DNA小片段)，再經(jīng)酶切后即可得到所需的粘性末端。（2）平端連接：在目的基因和載體分子上找不到匹配的限制性酶切點(diǎn)時(shí)，可采用平端連接法。少數(shù)酶酶切后能直接產(chǎn)生平末端，多數(shù)情況下先酶切產(chǎn)生粘性末端，再通過補(bǔ)平反應(yīng)后成為帶平末端的分子。雖然平端連接有更廣的適應(yīng)性，但重組效率遠(yuǎn)不如粘端連接，陽性重組子篩選的難度也更大。
四、將重組DNA引入宿主細(xì)胞
現(xiàn)用原核宿主細(xì)胞以大腸桿菌(E·coli)為主。在基因工程中，由于重組DNA是體外制備的，將其轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞后，可能會(huì)受到宿主細(xì)胞限制酶的切割。因此宿主菌必須是無限制基因(或作用)的突變株(r—株)，如常用的E·coli株HB101，DH1等。一般將噬菌體DNA引入宿主細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)染(transfection)，將質(zhì)粒DNA引入宿主細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)化(transformation)。
在導(dǎo)入重組DNA前，宿主菌用冷CaCl2溶液處理，使其細(xì)胞膜透性增加而成為感受態(tài)細(xì)胞，以利于重組DNA分子的進(jìn)入。
五、篩選與鑒定重組體克隆
兩者相輔相成，互相驗(yàn)證。陽性重組體的篩選可利用載體上的遺傳標(biāo)志，包括抗藥性(采用無抗藥性的受體菌)、氨基酸合成酸系(用缺該酶系的異養(yǎng)型受體菌)和顏色反應(yīng)(如α互補(bǔ)效應(yīng))等。另一種篩選方法是菌落雜交，將平皿上的轉(zhuǎn)化菌落轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜上，經(jīng)堿處理使DNA變性，然后用目的基因的標(biāo)記探針與之雜交，漂洗去多余的探針后進(jìn)行放射性自顯影，根據(jù)顯影片上的斑點(diǎn)可判斷含有目的基因的菌落。重組DNA的鑒定有多種方法，如限制性酶切圖譜、DNA測(cè)序，Southern印跡雜交等，可根據(jù)情況酌情使用
