血清免疫球蛋白的提取分離、純化及鑒定-7
7．低相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)（上海產(chǎn)），開封后溶于200ml 重蒸水，加200ul2 倍樣品緩沖液（還原緩沖液），分裝20 小管，-20℃ 保存。臨用前沸水浴3-5min。其相對分子質(zhì)量如下：
標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì) Mr
兔磷酸化酶B 97400
牛血清白蛋白 66 200
兔肌動蛋白 43 000
牛碳酸酐酶 31 000
胰蛋白酶抑制劑 20 100
雞蛋清溶菌酶 14400
8．質(zhì)量濃度為 10％過硫酸按：此溶液需臨用前配制。
9. 1.5％瓊脂：1.5g 瓊脂粉加l00ml 重蒸水，加熱至沸騰，未凝固前使用。
10．染色液：0.25g 考馬斯亮藍(lán)R250 ，加人91ml50 ％甲醇，9 ml 冰醋酸。
11．脫色液：50ml 甲醇，75ml 冰醋酸與875ml 重蒸水混合。
12. 待測相對分子質(zhì)量的樣品。
五、操作
1．將垂直平板電泳槽裝好，用1.5％瓊脂趁熱灌注于電泳槽平板玻璃的底部，以防漏。
2．分離膠的選擇和配制方法
(l）按照蛋白質(zhì)不同的相對分子質(zhì)量選用不同濃度的分離膠。
蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的范圍 分離膠的濃度
<104 20％-30%
1×104 - 4×104 15％-20%
4×104 - 1×105 10％-15%
1×105 - 5×105 5％-10%
>5×105 2％-5%
（2）不同分離膠的配制方法
3．分離膠的灌制
根據(jù)待測蛋白質(zhì)樣品的相對分子質(zhì)量選擇合適的分離膠濃度，本實驗選用12 ％的分離膠。在15ml 試管中依次加入重蒸水 3.
35ml、1.5mol/lTris - HCI ( pH8. 8 ）緩沖液2.5ml、10 % SDS 0.lml
、凝膠貯備液0.8ml、10％過硫酸銨25ul 和TEMED5ul，由于加入TEMED
后凝膠就開始聚合，所以應(yīng)立即混勻混合液，然后用滴管吸取分離膠，在電泳槽的兩玻璃板之間灌注，留出梳齒的齒高加 Icm
的空間以便灌注濃縮膠。用滴管小心地在溶液上覆蓋一層重蒸水，將電泳槽垂直靜置于室溫下約 30-60min
，分離膠則聚合，待分離膠聚合完全后，除去覆蓋的重蒸水，盡可能去干凈。
4．濃縮膠的配制和灌制
一般采用 5％的濃縮膠，配制方法：重蒸水 2.92ml、0.5mol/LTris-HCI 緩沖液（pH6.8
)1.25ml、10%SDS0.05rnl、凝膠貯備液4.0ml、10%過硫酸銨25ul、TEMED5ul，在試管中混勻，灌注在分離膠上。小心插人梳齒，避免混入氣泡，將電泳槽垂直靜置于室溫下至濃縮膠完全聚合（約30min）。
5．樣品的制備
（1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品的制備
取出一管預(yù)先分裝好的20ul 低相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，放人沸水浴中加熱3-5min，取出冷至室溫。
（2）待測蛋白質(zhì)樣品的制備
a . 10ulVEGF（約含 5ug VEGF）加10ul 2 倍還原緩沖液。
b . 10ul VEJ（約含5ug VEGF ) ，加10ul 2 倍非還原緩沖液。
以上a、b 兩管均同標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品一樣，在沸水浴中加熱 3-5min ，取出冷至室溫。
6．電泳
（1）待濃縮膠完全聚合后，小心拔出梳齒，用電極緩沖液洗滌加樣孔（梳孔）數(shù)次，然后將電泳槽注滿電極緩沖液。
（2）用微量注射器按號向凝膠梳孔內(nèi)加樣。
（3）接上電泳儀，上電極接電源的負(fù)極，下電極接電源的正極。打開電泳儀電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電流至 20-30mA 并保持電流強(qiáng)度恒定。待藍(lán)色的溴酚藍(lán)條帶遷移至距凝膠下端約Icm 時，停止電泳。
7．染色與脫色
小心將膠取出，置于一大培養(yǎng)皿中，在溴酚藍(lán)條帶的中心插一細(xì)鋼絲作為標(biāo)志。加染色液染色lh ，傾出染色液，加人脫色液，數(shù)小時更換一次脫色液，直至背景清晰。
8．相對分子質(zhì)量的計算
用直尺分別量出標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)、待測蛋白質(zhì)區(qū)帶中心以及鋼絲距分離膠頂端的距離，按下式計算相對遷移率：
相對遷移率=樣品遷移距離/染料遷移距離
以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Mr 的對數(shù)對相對遷移率作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)待測蛋白質(zhì)樣品的相對遷移率，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其相對分子質(zhì)量。
