血清γ-球蛋白的分離純化與鑒定（凝膠層析法）-2
（5）20%磺基水楊酸溶液
（6）奈氏(Nessler)試劑應(yīng)用液
貯存液；稱取碘化鉀(KI)7.58g于250ml三角燒瓶中，用蒸餾水5ml溶解，再加入碘（I2）
5.5g溶解，加7～7.5gHg用力振搖10min(此時(shí)產(chǎn)生高熱，須冷卻)，直至棕紅色的碘轉(zhuǎn)變成帶綠色的碘化汞鉀液為止，過濾上清液傾入100ml容量瓶，洗滌沉淀，洗滌液一并倒入容量瓶?jī)?nèi)，用蒸餾水稀釋至100ml。
應(yīng)用液：取貯存液75ml加10％NaOH 350ml，加水至500mL。
（7）0.9％氯化鈉溶液
（8）乙酸纖維素薄膜電泳有關(guān)試劑(見實(shí)驗(yàn)29)
易生物儀器庫(kù)：http://www.ebioe.com/yp/product-list-42.html
易生物試劑庫(kù)：http://www.ebioe.com/yp/product-list-43.html
2．器材
（1）人血清。
（2）層析柱。
（3）長(zhǎng)滴管。
（4）醋酸纖維素薄膜。
操作方法
1．鹽析――中性鹽沉淀
取正常人血清2.0ml于小試管中，加0.9％氯化鈉溶液2.0ml，邊攪拌混勻邊緩慢滴加飽和硫酸銨溶液乙4.0ml，混勻后于室溫中放置10min，3000r／min離心10min。小心傾去含有清蛋白的上清液，重復(fù)洗滌一次，于沉淀中加入0.0175mol／L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)0.5～1.Oml使之溶解。此液即為粗提的γ－球蛋白溶液。
2．脫鹽――凝膠柱層析
（1）裝柱：洗凈的層析柱保持垂直位置，關(guān)閉出口，柱內(nèi)留下約2.0ml洗脫液。一次性將疑膠從塑料接口加入層析柱內(nèi)，打開柱底部出口，調(diào)節(jié)流速0.3ml/min。凝腔隨柱內(nèi)溶液慢慢流下而均勻沉降到層析柱底部，最后使凝膠床達(dá)20厘米高，床面上保持有洗脫液，操作過程中注意不能讓凝膠床表面露出液面并防止層析床內(nèi)出現(xiàn)“紋路”。在凝膠表面可蓋一園形濾紙，以免加入液體時(shí)沖起膠粒。
（2）上樣與洗脫：可以在凝膠表面上加圓形尼龍濾布或?yàn)V紙使表面平整，小心控制凝膠柱下端活塞，使柱上的緩沖液面剛好下降至凝膠床表面，關(guān)緊下端出口，用長(zhǎng)滴管吸取鹽析球蛋白溶液，小心緩慢加到凝膠床表面。打開下端出口，將流速控制在0.25ml/min使樣品進(jìn)入凝膠床內(nèi)。關(guān)閉出口，小心加入少量0.0175mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)洗柱內(nèi)壁。打開下端出口，待緩沖液進(jìn)入凝膠床后再加少量緩沖液。如此重復(fù)三次，以洗凈內(nèi)壁上的樣品溶液。然后可加入適量緩沖液開始洗脫。
加樣開始應(yīng)立即收集洗脫液。洗脫時(shí)接通蠕動(dòng)泵，流速為0.5ml/min,用部分收集器收集，每管1ml。
（3）洗脫液中NH4+與蛋白質(zhì)的檢查：取比色板兩個(gè)(其中一個(gè)為黑色背底)，按洗脫液的順序每管取一滴，分別滴入比色板中，前者加20％磺基水楊酸溶液2滴，出現(xiàn)白色混濁或沉淀即示有蛋白質(zhì)析出，由此可估計(jì)蛋白質(zhì)在洗脫各管中的分布及濃度；于另一比色板中，加人奈氏試劑應(yīng)用液l滴，以觀察NH4+出現(xiàn)的情況。
合并球蛋白含量高的各管，混勻。除留少量作電泳鑒定外，其余用DEAE纖維素陰離子交換柱進(jìn)一步純化。
3．純化――DEAE纖維素陰離子交換層析
用DEAE纖維素裝柱約8-10cm高度，并用0.0175mol／L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)平衡，然后將脫鹽后的球蛋白溶液緩慢加于DEAE纖維素陰離子交換柱上，用同一緩沖液洗脫、分管收集。用20％磺基水楊酸溶液檢查蛋白質(zhì)分布情況。(裝柱、上樣、洗脫，收集及蛋白質(zhì)檢查等操作步驟同凝膠層析)。
4．濃縮
經(jīng)DEAE纖維素陰離于交換柱純化的γ－球蛋白液往往濃度較低。為便于鑒定，常需濃縮。收集較濃的純化的γ－球蛋白溶液2m1，按每ml加0.2～
0.25gSephadex G一25干膠，搖動(dòng)2～3min， 3000r／min 離心5min。上清液即為濃縮的γ-球蛋白溶液。
5．鑒定――乙酸纖維素薄膜電泳
取乙酸纖維素薄膜2條，分別將血清、脫鹽后的球蛋白、DEAE纖維素陰離子交換柱純化的γ-球蛋白液等樣品點(diǎn)上。然后參閱實(shí)驗(yàn)二十九：乙酸纖維薄膜電泳法進(jìn)行電泳分離、染色。比較電泳結(jié)果。
注意事項(xiàng)
1．凝膠及DEAE纖維處理期間，必須小心用傾瀉法除去細(xì)小顆粒。這樣可使凝膠及纖維素顆粒大小均勻，流速穩(wěn)定，分離效果好。
2．裝柱是層析操作中最重要的一步。為使柱床裝得均勻，務(wù)必做到凝膠懸液或DEAE纖維素混懸液不稀不厚，一般濃度為l：l，進(jìn)樣及洗脫時(shí)切勿使床面暴露在空氣中，不然柱床會(huì)出現(xiàn)氣泡或分層現(xiàn)象；加樣時(shí)必須均勻，切勿攪動(dòng)床面，否則均會(huì)影響分離效果。
3．本法是利用γ-球蛋白的等電點(diǎn)與α-、β-球蛋白不同，用離子交換層析法進(jìn)行分離的。因此層析過程中用的緩沖液pH要求精確。
4．電泳注意事項(xiàng)見實(shí)驗(yàn)二十九。
5．凝膠貯存：凝膠使用后如短期不用，為防止凝膠發(fā)霉可加防腐劑如0.02％疊氮鈉。保存于4℃冰箱內(nèi)。若長(zhǎng)期不用，應(yīng)脫水干燥保存。脫水方法：將膨脹凝膠用水洗凈。用多孔漏斗抽干后，逐次更換由稀到濃的乙醇溶液浸泡若干時(shí)間，最后一次用95％乙醇溶液浸泡脫水，然后用多孔漏斗抽干后，于60～80℃烘干貯存。
6．離子交換劑的再生和保存；離子交換劑的價(jià)格較貴，每次用后只需再生處理便能反復(fù)使用多次。處理方法是：交替用酸、堿處理，最后用水洗至接近中性。陽(yáng)離子交換劑最后為Na型，陰離子以Cl型是最穩(wěn)定型，故陰離子交換劑處理順序?yàn)閴A一水一酸一水。由于上述交換劑都是糖鏈結(jié)構(gòu)。容易水解破壞，因此須避免強(qiáng)酸、強(qiáng)堿長(zhǎng)時(shí)間浸泡和高溫處理，一般纖維素浸泡時(shí)間為3-4h。
離子交換劑容易長(zhǎng)霉引起變質(zhì)，不用時(shí)，需洗滌干凈，加防腐劑置冰箱內(nèi)保存。常用0.02％疊氮鈉防腐。疊氮鈉遇酸放出有毒氣體，也是劇毒與易爆的危險(xiǎn)品。使用時(shí)要加倍小心。
除用凝膠層析法去除無機(jī)鹽類外，最常用的去鹽法就是透析。細(xì)的透析袋效率高，所需時(shí)間短。將透析袋一端折疊，用橡皮筋結(jié)扎，試驗(yàn)是否逸漏，然后倒入待透析的蛋白質(zhì)溶液。勿裝太滿，將袋的上端也結(jié)扎好，即可進(jìn)行透析。開始可用流動(dòng)的自來水，待大部分鹽被透析出后，再改為生理鹽水、緩沖液或蒸餾水。透析最好在較低的溫度下，并在磁力攪拌器上進(jìn)行。此法簡(jiǎn)單，易操作，儀器及試劑要求不高，但不如凝膠層析法效率高。
濃縮γ-球蛋白粗提液除上述方法外還可用透析袋濃縮。將待濃縮的蛋白質(zhì)溶液放入較細(xì)的透析袋中，置入搪瓷盤內(nèi)。透析袋周圍可撒上聚乙二醇6000(PEG6000)，或聚乙烯吡咯酮，或蔗糖。以上物質(zhì)在使用后(吸了大量水)都可以通過加溫及吹風(fēng)而回收；將裝有蛋白質(zhì)溶液的透析袋懸掛起來，用電風(fēng)扇高速吹風(fēng)(10℃以下)，也可達(dá)到濃縮目的，以上兩法雖不如
SephadexG一25干膠快，但價(jià)格較便宜，方法也不煩瑣。
