實驗?zāi)康?/strong>
? ? ?1、掌握最常用的提取質(zhì)粒DNA的方法和檢測方法；
? ? ? 2、了解制備原理及各種試劑的作用。

? ? ?實驗原理

堿裂解法是基于DNA的變性與復(fù)性差異而達到分離目的的。堿性使質(zhì)粒DNA變性，再將pH值調(diào)至中性使其復(fù)性，復(fù)性的為質(zhì)粒DNA，而染色體DNA不會復(fù)性，纏結(jié)成網(wǎng)狀物質(zhì)，通過離心除去。

細(xì)菌質(zhì)粒是一類雙鏈、閉環(huán)的DNA，大小范圍從1kb至200kb以上不等。各種質(zhì)粒都是存在于細(xì)胞質(zhì)中、獨立于細(xì)胞染色體之外的自主復(fù)制的遺傳成份，通常情況下可持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)，但在一定條件下也會可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制，并通過細(xì)胞分裂傳遞到后代。

質(zhì)粒已成為目前最常用的基因克隆的載體分子，重要的條件是可獲得大量純化的質(zhì)粒DNA分子。目前已有許多方法可用于質(zhì)粒DNA的提取，本實驗采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA。

堿裂解法是一種應(yīng)用最為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法，堿變性抽提質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達到分離目的。在pH值高達12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性。

質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環(huán)狀的兩條互補鏈不會完全分離，當(dāng)以pH4.8的NaAc/KAc高鹽緩沖液去調(diào)節(jié)其pH值至中性時，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來的構(gòu)型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。

?一、材料
?含pUC19質(zhì)粒的大腸桿菌，1.5ml塑料離心管，離心管架，槍頭及盒、衛(wèi)生紙。

?二、設(shè)備
?微量移液器(20μl，200μl，1000μl)， 臺式高速離心機，恒溫振蕩搖床， 高壓蒸汽消毒器(滅菌鍋)， 渦旋振蕩器，恒溫水浴鍋，雙蒸水器，冰箱等。

?三、試劑準(zhǔn)備
?1、 LB液體培養(yǎng)基：稱取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5g，NaCl 10g，溶于800ml去離子水中，用NaOH調(diào)pH至7.5，加去離子水至總體積1升，高壓下蒸氣滅菌20分鐘。

2. 氨芐青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成 100mg/ml水溶液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3. 溶液Ⅰ：50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。

1M Tris-HCl (pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在121℃高壓滅菌15min ，貯存于4℃

4. 溶液Ⅱ：0.2M NaOH，1% SDS。

2M NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前臨時配置。

5. 溶液Ⅲ：醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH 4.8。

5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2 O至500ml。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

6. TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。

1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。121高壓濕熱滅菌20min，4℃保存?zhèn)溆?/p>

1M Tris Cl（Tris(三羥甲基)氨基甲烷）：800ml H2O中溶解 121g Tris堿，用濃鹽酸調(diào)pH值，混勻后加水到1L；

0.5M EDTA（乙二胺四乙酸）：700ml H2O中溶解186.1g Na2 EDTA-2H2 O，用10M NaOH調(diào) pH8.0(需約50ml)， 補H2O到 1L。

7. 苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）。氯仿可使蛋白變性并有助于液相與有機相的分開，異戊醇則可起消除抽提過程中出現(xiàn)的泡沫。酚和氯仿均有很強的腐蝕性，操作時應(yīng)戴手套。

8. 無水乙醇；

9. 70%乙醇；

10. RNA酶A母液：將RNA酶A溶于10mmol/L Tris?Cl(pH7.5)，5mmol/L NaCl中，配成10mg/ml的溶液，于100℃加熱15分鐘，使混有的DNA酶失活。冷卻后用1.5ml eppendorf管分裝成小份保存于-20℃。

11 滅菌雙蒸水ddH2 O

?四、操作步驟
?1. 挑取LB固體培養(yǎng)基上生長的單菌落，接種于20ml LB（含Amp100ug/ml）液體培養(yǎng)基中，37℃、250rmp振蕩培養(yǎng)過夜（約12-14hr）。

2. 取1.5ml培養(yǎng)液倒入1.5ml eppendorf管中，12000rmp離心1-2min。棄上清，將離心管倒置于衛(wèi)生紙上幾分鐘，使液體盡可能流盡。

3、菌體沉淀重懸浮于100μl溶液Ⅰ中(需劇烈振蕩，使菌體分散混勻。),室溫下放置5-10 min。

4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl，蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendorf管數(shù)次，以混勻內(nèi)容物(千萬不要振蕩)，冰浴5 min，使細(xì)胞膜裂解（溶液Ⅱ為裂解液，故離心管中菌液逐漸變清）。

5、加入150μl預(yù)冷的溶液Ⅲ，蓋緊管口，將管溫和顛倒數(shù)次混勻，見白色絮狀沉淀，可在冰上放置5min。 12000rmp離心10min。溶液Ⅲ為中和溶液，此時質(zhì)粒DNA復(fù)性，染色體和蛋白質(zhì)不可逆變性，形成不可溶復(fù)合物，同時K+使SDS-蛋白復(fù)合物沉淀。

6、上清液移入干凈eppendorf管中，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，振蕩混勻，12000rmp離心10min。（450μl的苯酚/氯仿/異戊醇。）

7、小心移出上清于一新微量離心管中，加入2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，混勻，室溫放置 2-5min，離心12000rmp×10min。

8、棄上清，將管口敞開倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出，加入1ml 70％乙醇洗沉淀一次，12000rmp離心5 min。

9、 吸除上清液，將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡，室溫干燥。

10、將沉淀溶于20μl TE緩沖液(pH8.0，含20μg /ml RnaseA，約4μl)中，37℃水浴30min以降解RNA分子，儲于-20℃冰箱中。
　
? ? 注意事項

1. 提取過程應(yīng)盡量保持低溫。

2. 沉淀DNA通常使用冰乙醇，在低溫條件下放置時間稍長可使DNA沉淀完全。沉淀DNA也可用異丙醇(一般使用等體積)，且沉淀完全，速度快，但常把鹽沉淀下來，所以多數(shù)還是用乙醇。