DNA重組（DNA recombination）技術(shù)：DNA重組的載體-2
二、噬菌體載體
作為細(xì)菌寄生物的噬菌體，大多數(shù)具有編碼多種蛋白質(zhì)的基因，能利用宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成體系，進(jìn)行生長和增殖。構(gòu)建的噬菌體載體，以λ噬菌體、M13和粘粒最為常用。
㈠ λ噬菌體載體
野生型λDNA是一種基因組為4.8 kb的線性雙鏈DNA，全部序列已知，共編碼50多個(gè)基因。其中約一半基因參與了噬菌體的生命周期活動(dòng)，稱為必需基因；另一部分基因，當(dāng)被外源基因取代后，并不影響噬菌體的生命功能。另外，在分子兩端各有12個(gè)堿基的互補(bǔ)單鏈，是天然的粘性末端，稱cos位點(diǎn)。
野生型的λ噬菌體是一種中等大小的溫和噬菌體，即既能進(jìn)入溶菌性生命周期又能進(jìn)入溶源性生命周期。λ噬菌體感染細(xì)菌后，λDNA通過粘性末端而環(huán)化。既可溶菌性生長（裂解），即λDNA在宿主中多次復(fù)制并合成大量基因產(chǎn)物，裝配成噬菌體顆粒，最后裂解宿主菌；又可以溶源性生長，即λDNA整合到宿主染色體基因組DNA中，與之一起復(fù)制并遺傳給子代，但宿主細(xì)胞不被裂解。裂解途徑和溶源途徑的選擇取決于宿主與噬菌體之間的許多因素的相互作用，以及噬菌體基因組的精確調(diào)控。
λ噬菌體具有二個(gè)重要特征，使之成為一類重要的、很有價(jià)值的基因克隆載體。①除必需基因外的功能相關(guān)（溶源生長和重組）基因成簇排列在一起位于中間部分，約占全基因組的30%，不是溶菌生長所必需的。因此，該區(qū)可缺失或作外源DNA的插入?yún)^(qū)。②噬菌體顆粒成熟的包裝過程（外殼蛋白包裝DNA），只要重組DNA不小于野生型λDNA全長75%和大于105%，均可被包裝成具有噬菌體活性的成熟顆粒。因此大約可插入長達(dá)15kb的外源DNA。
當(dāng)外源DNA片段克隆到插入型載體上，噬菌體便喪失某些生物學(xué)功能，即插入失活效應(yīng)。又可分為免疫功能失活的和β-半乳糖苷酶失活的兩種亞型。①免疫功能失活的插入型載體。插入位點(diǎn)位于基因組中的免疫編碼區(qū)，外源DNA片段插入后，就會(huì)使載體合成阻遏蛋白的能力被破壞，導(dǎo)致不能進(jìn)入溶源生長周期。因此凡有外源DNA插入的λ重組體都會(huì)形成清晰的噬菌斑，而未有外源DNA插入空載體則形成混濁的噬菌斑。這種形態(tài)上的差別，為分離陽性重組體提供了方便的選擇標(biāo)記。②大腸桿菌β-半乳糖苷酶失活型載體。插入位點(diǎn)位于基因組中的β-半乳糖苷酶（LaZ）編碼區(qū)，因此可通過藍(lán)白斑實(shí)驗(yàn)篩選。對(duì)于替換型載體，當(dāng)外源DNA插入時(shí)，一對(duì)克隆位點(diǎn)間的基因組DNA被替換（取代），從而喪失某些生物學(xué)功能，造成重組體與空載體形成噬菌斑形態(tài)（清晰和混濁）或顏色（藍(lán)白斑實(shí)驗(yàn)）差別，這種差別即可作為篩選標(biāo)記。
這兩類λ噬菌體載體具有不同的特點(diǎn)，在基因克隆中的用途也不盡相同。插入型載體只能容納較小分子的外源DNA片段（一般在10kb以內(nèi)），廣泛用于cDNA及小片段DNA的克隆。而替換型載體則可容納較大分子的外源DNA片段，可用于高等生物染色體DNA片段克隆。但不管是哪種類型，體外重組體DNA分子，其大小應(yīng)不小于野生型λDNA的75%和不大于105%，否則不能包裝成有活性的噬菌體顆粒。
λ噬菌體載體結(jié)構(gòu)舉例說明。
λgt10（插入型）和Charon 40（替換型）結(jié)構(gòu)示意
㈡ 粘粒載體
粘粒又稱柯斯質(zhì)粒（cosmid），“cosmid”一詞是“cos site-arrying plasmid”的縮寫，其原意是指帶有粘性末端位點(diǎn)（cos）的質(zhì)粒。粘粒載體由質(zhì)粒和λ噬菌體的cos粘性末端構(gòu)建成而成。其質(zhì)粒DNA部分是一個(gè)完整的復(fù)制子，包括復(fù)制起始位點(diǎn)、一個(gè)或多個(gè)酶切位點(diǎn)和抗菌素抗藥性基因（Ampr和/或Tetr），因此粘粒也能象質(zhì)粒一樣用標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入大腸桿菌和進(jìn)行篩選；其λ噬菌體片段帶有一個(gè)將DNA包裝到λ噬菌體顆粒中所需的序列，除了cos粘性末端之外，在其兩端還具有與噬菌體包裝有關(guān)的短序列，故又能被包裝成具有感染性的噬菌體顆粒。很明顯粘粒兼具了質(zhì)粒和噬菌體二者的優(yōu)點(diǎn)。
目前已經(jīng)發(fā)展出了許多不同類型的粘粒載體，例如c2XB、pHC79、pTL5、pJC74、pJC720、pJB6和pJB8等。粘粒載體大體上有以下四方面的特點(diǎn)：
1．具有λ噬菌體的特征 粘粒載體在體外克隆了適當(dāng)長度的外源DNA并被包裝成噬菌體顆粒之后，可以似λ噬菌體一樣高效地轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)λ噬菌體敏感的大腸桿菌寄主細(xì)胞。進(jìn)入寄主細(xì)胞的粘粒DNA分子，便按照λ噬菌體DNA同樣的方式環(huán)化并進(jìn)入溶源周期。但由于不能夠通過溶菌周期，無法形成子代噬菌體顆粒。
2．具有質(zhì)粒載體特征 粘粒載體有質(zhì)粒復(fù)制子，因此在寄主細(xì)胞內(nèi)亦能象質(zhì)粒DNA一樣進(jìn)行復(fù)制，并且在氯霉素作用下也能獲得進(jìn)一步的擴(kuò)增。另外，粘粒載體還通常具有抗菌素抗性基因，可作為重組體分子的篩選標(biāo)記。
3．具有高容量的克隆能力 粘粒載體僅含一個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)、一二個(gè)選擇標(biāo)記和cos位點(diǎn)三個(gè)部分，其本身大小僅為5～7kb。因此插入外源DNA片段可大到45kb。這一裝載容量比λ噬菌體載體和質(zhì)粒載體要大得多。
4．具有與同源序列的質(zhì)粒進(jìn)行重組的能力 粘粒載體能與共存于同一寄主細(xì)胞中的帶有共同序列的質(zhì)粒進(jìn)行重組，形成共合體。當(dāng)一個(gè)粘粒載體與帶有不同抗藥性標(biāo)記的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化同一寄主細(xì)胞時(shí)，便可篩選到具有相容性復(fù)制起點(diǎn)的共合體分子。
粘粒載體pJB8
㈢ 單鏈絲狀噬菌體載體
大腸桿菌的絲狀噬菌體包括M13噬菌體、f1噬菌體和fd噬菌體，其基因組都是一個(gè)長度6.4kb且彼此同源性很高的單鏈閉環(huán)DNA分子。下面以M13為例簡要介紹單鏈絲狀噬菌體載體的特點(diǎn)。
M13噬菌體顆粒外形成絲狀，是一種既不溶源也不裂解宿主細(xì)胞的噬菌體。其感染型是單鏈DNA（＋鏈），感染宿主（通常是大腸桿菌）后，借助宿主的酶系統(tǒng)，先將單鏈DNA復(fù)制為雙鏈DNA（復(fù)制型），復(fù)制型在菌體內(nèi)繼續(xù)增殖，可達(dá)200拷貝。感染的細(xì)胞能夠繼續(xù)生長和分裂，每個(gè)細(xì)胞每個(gè)世代可釋放出1 000個(gè)左右的子代噬菌體顆粒。因此培養(yǎng)基中可收集到大量的M13噬菌體顆粒。
通過對(duì)M13噬菌體進(jìn)行改造，已成功地發(fā)展出了M13mp噬菌體載體系列，例如M13mp8、M13mp9和M13mp10、M13mp11等。M13mp系列都是從同一個(gè)重組體（M13mp1）改造而來的，在M13主要基因間隔區(qū)插入了帶有大腸桿菌LacZ的調(diào)控序列和N端頭146個(gè)氨基酸的編碼信息，且在其中插入了多克隆位點(diǎn)序列。因此重組體也可用IPTG-X-gal藍(lán)白斑實(shí)驗(yàn)進(jìn)行篩選；M13mp系列大多是成對(duì)的，且有pUC質(zhì)粒系列的多克隆位點(diǎn)與之對(duì)應(yīng)。
