三分鐘了解4代基因測序技術(shù)
基因檢測技術(shù)是近年來伴隨“精準醫(yī)療”概念的提出而迅速發(fā)展起來的一門科學技術(shù)，它可以從基因組機制上闡釋遺傳學、發(fā)育生物學、進化生物學等學科的經(jīng)典概念，在全基因組水平延伸了染色體高級構(gòu)象、細胞異質(zhì)性、功能模塊等新概念，為精準醫(yī)學開辟了應用性新領(lǐng)域。
近年來，隨著分子水平的基因檢測技術(shù)平臺不斷發(fā)展和完善，基因檢測成為臨床診斷和研究的熱點?；驒z測技術(shù)應用于遺傳病診斷、罕見病、產(chǎn)前篩查、臨床個體用藥以及腫瘤監(jiān)診斷療等領(lǐng)城的科研成果也層出不窮。
目前，應用較廣的基因檢測技術(shù)大致分三類：基因測序、以核酸擴增為基礎(chǔ)的PCR技術(shù)，以熒光雜交檢測為基礎(chǔ)的FISH技術(shù)。這三類技術(shù)溝通構(gòu)成了基因檢測基礎(chǔ)，大部分基因檢測項目都有賴于這三項基礎(chǔ)技術(shù)開展。與PCR和FISH技術(shù)相比，基因測序技術(shù)可直接讀取DNA分子的30億個堿基序列，具有高通量、數(shù)據(jù)量大的特點。此外，基因芯片技術(shù)應用范圍也較廣。
基因檢測技術(shù)對比
在本文中，小編匯總了4代基因測序技術(shù)并比較其優(yōu)缺點，以期幫助正在從事基因檢測工作或行業(yè)的您，了解這項技術(shù)的發(fā)展歷程。
基因組學與基因檢測技術(shù)的概述
基因組學是伴隨“人類基因組計劃”發(fā)展起來的一門新興學科，是新世紀科學的莫基學科，已成為生命科學發(fā)展的基礎(chǔ)性和引領(lǐng)性學科。20世紀50年代， Watson和 Crick提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)后，人們對基因的遺傳學功能逐漸有所認識，并開始致力于DNA序列檢測的探索。1975年 Sanger等發(fā)明了第一代測序技術(shù)并在1980年完成了人類歷史上第一個基因組序列?——噬菌體X174的測序，它標志著人類正是進入基因組學時代。從1985年人類基因組計劃提出，到2001年人類基因組草圖完成，基因組學的研究也從以全基因組測序轉(zhuǎn)向以基因功能鑒定為日標的后基因組時代。
基因檢測技術(shù)經(jīng)過近70年的發(fā)，從第一代的雙脫氧鏈測序技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到第四代固態(tài)納米測序技術(shù)。測序技術(shù)的發(fā)展使人們能夠方便準確地獲取大量的基因組信息，并將其應用于疾病的研究，借此人們遜漸認識到基因變異與疾病發(fā)生發(fā)晨的關(guān)系。同時，基因檢測技術(shù)也越來越多地被應用于疾病的臨床診斷和治療。
第一代測序技術(shù)
早在1954年， Whitfeld就已經(jīng)報道使用層析法測定了多聚核糖核苷酸的序列。第一代測序技術(shù)的標志是 Sanger于1977年發(fā)明的DNA雙脫氧核苷酸末端終止測序法，以及 Maxam和 Gilbert于同年發(fā)明的DNA化學降解測序法。其中， Sanger法的核心原理是:由于dNTP的2'和3'都不含羥基，在DNA的合成過程中不能形成磷酸二酯鍵，因此可以用來中斷DNA合成反應。在4個DNA合成反應體系中分別加入一定比例帶有放射性同位素標記的 ddNTP(分別為: ddATP、dCTP、dGTP和drP)，通過凝膠電泳和放射自顯影后可以根據(jù)電泳帶的位置確定待測分子的DNA序列。
Sanger測序工作流程
Sanger測序技術(shù)操作快速、簡單，因此被廣泛應用。20世紀80年代末，熒光標記技術(shù)憑借著更加安全簡便的特性，逐步取代同位素標記技術(shù)，由此也誕生了自動化測序技術(shù)。由于可以用不同熒光標記4種dNTP，使得最后產(chǎn)物的電泳分離過程可以在一個泳道內(nèi)實現(xiàn)，用激光對 ddNTP上的熒光標記進行激發(fā)，然后檢測不同波長的信號，通過計算機處理信號后可獲得堿基序列，很好地解決了原技術(shù)中不同泳道遷移率存在差異的問題。自動化儀測序大大提高了測序效率，如ABI3730和 Amersham MEGABACE測序儀分別可以在一次運行中分析96個或384個樣本。第代測序儀在人類基因組計劃DNA測序的后期階段起到了關(guān)鍵的作用，使人類基因組計劃比原計劃提前兩年完成。
雙脫氧鏈末端終止法的優(yōu)點:
（1）可用于未知或已知突變的檢測，更容易實行；
?。?）假條帶的出現(xiàn)減少，結(jié)果更加清楚；
（3）讀取的長度也較長；
（4）因為摻入了同位素標記的三磷酸，末端終止法可以測更小序列的核苷酸鏈；
?。?）基本適用于所有的突變類型，準確率幾乎100%，在單基因病的基因診斷和產(chǎn)前診斷中仍廣泛。
使用雙脫氧末端終止法的缺點：
?。?）離不開PCR擴增，且只能分析單個的DNA片段，通量小，不能進行基因組層面的分析；
?。?）自動化程度低，檢測速度慢，對于某些需要快速檢測的疾病不適合；
?。?）雙脫氧鏈末終止法成本高，不適用于大規(guī)模測序。
第二代測序技術(shù)（NGS）
當前最具代表性的第二代測序平臺包括:瑞土羅氏公司( Roche)的454測序儀、美國 Illumina公司的Solexa基因組測序儀、美國ABI公司的 SOLID測序儀等。第二代測序技術(shù)的原理是邊合成邊測序，即依照第一代 Sanger測序技術(shù)的原理，通過測序儀器捕捉新?lián)饺说哪┒藷晒鈽擞泚泶_定DNA序列組成。鑒于Illumina的NGS技術(shù)已經(jīng)成為市場主流，因此接下來將詳細介紹Illumina的Solexa測序技術(shù)的。
Solexa測序工作流程
Solexa測序核心技術(shù)是DNA簇和可逆終止化學反應。測序前先將模板樣品DNA片段打碎形成100~200bp的片段，然后在這些片段兩端加上特定的測序接頭。而 Solexa高通量測序芯片表面附著一層單鏈引物，兩端連有接頭的單鏈DNA片段通過與芯片表面的引物堿基互補結(jié)合，經(jīng)PCR擴增成為雙鏈。至此DNA的一端就被錨定在測序芯片上，而另一端則隨機和附近的引物互補結(jié)合，從而也被固定住，形成“橋式結(jié)構(gòu)。這樣經(jīng)過反復30輪擴增循環(huán)后，每個DNA片段得到約1000倍擴増，形成單克隆DNA簇。然后摻入經(jīng)過改造的DNA聚合酶和帶有4種熒光標記的DNTP。這些dNTP就是“可逆終止子”，其3'羥基端帶有可化學切割的部分，每個循環(huán)只允許摻入1個堿基用激光掃描測序芯片表面，讀取聚合上去的相關(guān)核苷酸種類。隨后將這些核苷酸化學切割，恢復3'端黏性。繼續(xù)聚合核苷酸。如此循環(huán)，直至每條模板序列都被聚合成雙鏈。此過程中帶有熒光標記的dTP能夠釋放出相應的熒光，測序儀據(jù)此捕捉熒光信號，之后計算機可以將熒光信號轉(zhuǎn)化為不同顏色的測序峰圖，便可得知測序樣品的DNA序列
較第一代測序技術(shù)而言，第二代測序技術(shù)的測量通量顯著提高，是目前市場上主流的測序技術(shù)。但邊合成邊測序的原理也為其帶來相應不足之處，測序讀長較短和需要模板擴増是兩個主要的弊端所在。第二代測序的讀長一般在700bp左右，為后續(xù)的序列拼接、組裝及注釋等生物信息學分析帶來了較大困難；由于PCR反應的靈敏性，導致擴增前后得到的DNA分子片段的數(shù)目有較大偏差，因此在分析基因表達方面存在較大的弊端。在此基礎(chǔ)上，無需擴増、讀長更長的第三代測序技術(shù)便應運而生。
NGS的優(yōu)勢:
?。?）高通量，高淮確性，高靈敏度；
?。?）自動化程度高；
（3）成本低；
（4）可用于未知物種，未知基因的檢測。
第三代測序技術(shù)（單分子DNA測序）
第三代測序技術(shù)基于單分子讀取技術(shù)，不需要PCR擴增，具有巨大的應用前景?，F(xiàn)有的第三代測序平臺包括美國 Helicos Bioscience公司的 Heliscope遺傳分析系統(tǒng)和 Paciffic Biosciences公司的單分子實時測序系統(tǒng)(SMRT)。兩者均繼承了第二代測序技術(shù)的邊合成邊測序的原理，其中SMRT系統(tǒng)是基于零級波導( zero mode waveguide， ZMW)的測序技術(shù)。ZMW是種直徑50~100m、深約100mm的孔狀納米光電結(jié)構(gòu)，當光線進人后呈指數(shù)衰減，僅靠近基底的部分被照亮。DNA聚合酶被固定在ZMW底部，加入模版、引物和4色熒光標記的dTP后進行DNA合成，只有參加反應的dNTP才能停留在ZMW底部，從而使dNTP的熒光信號被識別。
第三代測序技術(shù)是計算機學、生物學、化學等多個學科領(lǐng)域研究相結(jié)合的結(jié)晶，功能非常強大。其顯著特點是單分子測序，即不經(jīng)PCR，可直接進行邊合成邊測序。這不僅簡化了樣品處理過程，避免了擴增可能引入的錯配，而且不受A、T、G、C這4種堿基含量的影響，因此第三代測序技術(shù)能直接對RNA和甲基化DNA序列進行測序。
SMRT優(yōu)點：
?。?）超長讀??；
?。?）無需模板擴增；
?。?）運行時間短，讀取速度可達每秒10個堿基；
?。?）能夠直接檢測表觀修飾位點。
第四代測測序技術(shù)（納米孔測序）
目前，第二、三代測序技術(shù)均是基于光信號的測序技術(shù)，都需要昂貴的光學監(jiān)測系統(tǒng)，并依賴DNA聚合酶讀取堿基序列，大大地増加了測序的成本。因此開發(fā)不使用生物化學試劑，直接讀取DNA序列信息的新型測序方法，就成為第四代測序技術(shù)的主要思想。其中的代表當屬納米孔測序，如英國 Oxford Nanopore Technologies公司所開發(fā)的納米孔測序，是基于電信號的測序技術(shù)。它利用鑲嵌于脂質(zhì)雙分子層中的經(jīng)過基因工程改造過的-溶血素蛋白作為納米孔道，孔內(nèi)共價結(jié)合有分子接頭。由于A、T、G、C這4種堿基存在電荷差異，當DNA堿基通過納米孔時，從而短暫地影響流過納米孔的電流強度(4種堿基所影響的電流變化幅度各不相同)，靈敏的電子設(shè)備檢測到這些變化從而鑒定所通過的堿基。雖然納米孔測序的優(yōu)點十分明顯，與前幾代技術(shù)相比在成本、速度方面有著很大優(yōu)勢。但是目前還處在起步階段，在關(guān)鍵環(huán)節(jié)(如納米孔的制造和DNA分子通過納米孔的速度控制方面)還有待改善。
展望
縱觀基因組測序技術(shù)的發(fā)展歷程可以看出，從第一代到第四代測序技術(shù)無一例外地均以提高測序通量與讀長、降低測序成本、簡化測序步驟為目標。盡管目前最為先進的納米測序技術(shù)具有諸多進步，但仍面臨很多挑戰(zhàn)。我們有理由相信，當前新一代測序技術(shù)面臨的難點會逐漸攻破，基因測序指導下的遺傳病診治、精準醫(yī)療等能夠更加高效的進行。
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