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固定化α-淀粉酶及活性測定

2020.9.07

一、實驗?zāi)康暮驮?br>
目的:學(xué)會交聯(lián)法制備固定化酶的操作技術(shù)

內(nèi)容:制備固定化酶的方法很多,利用雙功能試劑或多功能試劑在酶分子間,酶分子與惰性蛋白間,或酶分子與載體間進行交聯(lián)反應(yīng),以共價鍵制備固定化酶的方法稱為交聯(lián)法,本實驗即采用這種方法。交聯(lián)劑為戊二醛,載體為甲殼素。

二、實驗器材

1.恒溫水浴鍋

2.恒溫振搖儀

三、實驗試劑

1. 5%戊二醛

2. 甲殼素

3. 碘原液:稱取碘1.1g。碘化鉀2.2g,置于小燒杯中,加10ml蒸餾水使之溶解,然后轉(zhuǎn)入容量瓶中。再加少量的蒸餾水洗滌燒杯數(shù)次,洗滌液均轉(zhuǎn)入容量瓶中,最后定容至50ml。搖均后放于棕色試管中備用。

4. 比色稀碘液:取碘原液2ml,加碘化鉀20g,再用蒸餾水定容至5000ml。

5. 2%淀粉溶液:稱取2g可溶淀粉,放入小燒杯中,加少量蒸餾水做成懸浮液。然后在攪拌下注入沸騰的蒸餾水中,繼續(xù)煮沸一分鐘,冷卻后加蒸餾水定容至100ml。

6. pH6磷酸氫二鈉——檸檬酸緩沖液:稱取磷酸二氫鈉(Na2HPO4.12H2O)45.23g,檸檬酸(C6H8O7.H2O)8.07g,先在燒杯中使之溶解,然后轉(zhuǎn)入容量瓶中定容至1000ml。

7. 標(biāo)準(zhǔn)終點色溶液,

A液:精確稱取氯化鈷(CoCl.6H2O)40.2493g和重洛酸鉀(K2GrO7)0.4878g,用蒸餾水定容至500ml.

B液::精確稱取絡(luò)黑T40mg,用蒸餾水定容至100ml.

同時取A液40ml、B液5ml、混合后置于冰箱中待用?;旌弦涸?5天內(nèi)使用有效。

四、實驗操作

(一)酶液的制備

精確稱取α-淀粉酶2g,先用少量40℃pH6的磷酸二氫鈉——檸檬酸緩沖液溶解,溶解過程中輕輕用玻璃棒搗研。將上層液小心傾入100ml容量瓶,沉渣部分再加入少量上述緩沖液,如此反復(fù)搗研3—4次。最后,將溶液與殘渣全部移入容量瓶中,用緩沖液先定容搖勻后,通過四層紗布過濾,溶液供測定使用。
(二)固定化酶的制備

1. 稱取50mg粉末甲殼素,加入5%戊二醛10ml,調(diào)節(jié)pH=8.5,攪拌均勻后,于25℃,恒溫振搖1小時。取出后,傾去戊二醛,然后以蒸餾水洗滌,傾去清夜,以除去多余的交聯(lián)劑。

2. 取前面制備的酶液10ml,與上述處理的甲殼素混合均勻,25℃,恒溫振搖1小時,然后4℃冰箱放置過夜。

1.取出后,4000rpm離心分離,傾去清液,蒸餾水洗滌,可得固定化酶。

(三)固定化α-淀粉酶活力測定及活力回收率的計算

1. 首先用吸管取1ml的標(biāo)準(zhǔn)終點色溶液,加至白瓷板的空穴內(nèi),作為終點參照的標(biāo)準(zhǔn)。

2. 固定前總酶活力測定:取20ml 2%的可溶淀粉液與5mLpH6的磷酸氫二鈉——檸檬酸緩沖液,加入一支大試管中。將試管置于60℃水浴5分鐘。然后加入前面制備的酶液0.5ml。搖勻后,立即用秒表記錄時間。此后,每經(jīng)一段時間,用吸管吸出0.2ml反應(yīng)液,加入預(yù)先盛入稀碘液的白瓷板中。當(dāng)穴內(nèi)顏色反應(yīng)由紫色逐漸變?yōu)榧t棕色并與標(biāo)準(zhǔn)色相同時,即為反應(yīng)終點,記錄反應(yīng)到達終點時的時間。

3. 固定化酶活力測定:取20ml 2%的可溶淀粉液與5mLpH6的磷酸氫二鈉——檸檬酸緩沖液,加入一支大試管中。將試管置于60℃水浴5分鐘。然后加入前面制備的固定化酶。搖勻后,立即用秒表記錄時間。此后,不斷振搖,每經(jīng)一段時間,用吸管吸出0.2ml反應(yīng)液,加入預(yù)先盛入稀碘液的白瓷板中。當(dāng)穴內(nèi)顏色反應(yīng)由紫色逐漸變?yōu)榧t棕色并與標(biāo)準(zhǔn)色相同時,即為反應(yīng)終點,記錄反應(yīng)到達終點時的時間。

4. 酶活力計算:以60℃、pH6的條件下,每小時水解1g淀粉的酶量為一個活力單位。

固定前原酶活力單位 = 60/T×20×2%×n/0.5

固定后的酶活力單位 = 60/T×20×2%×n/10

T:反應(yīng)到終點時的時間(分)

n:酶粉稀釋的倍數(shù)

5. 固定化后酶活力回收率計算:

酶活力回收率=(固定后的酶活力單位/固定前原酶活力單位) × 100%

五、注意事項

測定酶制劑時,應(yīng)先在40℃水浴中懸浮2小時,再用紗布過濾。每次操作所用的紗布數(shù)要一致。


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