DNA酶切及凝膠電泳
實驗概要
本文介紹了DNA酶切及凝膠電泳的實驗原理、儀器試劑和操作步驟等。
實驗原理
DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點的pH溶液中帶負電荷在電場中向正極移動。由于糖－磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此他們能以相同的速度向正極方向移動。在一定的電場強度下，DNA ?分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即DNA 分子本身的大小和構(gòu)型。具有不同的相對分子質(zhì)量的DNA 片段泳動速度不一樣，可進行分離。DNA ?分子的遷移速度與相對分子質(zhì)量對數(shù)值成反比關(guān)系.。凝膠電泳不僅可以分離不同相對分子質(zhì)量的DNA，也可以分離相對分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA分子。如pUC19 ?質(zhì)粒，有3種構(gòu)型：超螺旋的共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA(covalently closed circular ?DNA，簡稱CCCDNA)，開環(huán)質(zhì)粒DNA，即共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA1條鏈斷裂，(open circular ?DNA，簡稱OCDNA)，線狀質(zhì)粒DNA ，即共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA2 條鏈發(fā)生斷裂，(linear DNA，簡稱L ?DNA)。這3種構(gòu)型的質(zhì)粒DNA分子在凝膠電泳中的遷移率不同。因此電泳后呈3 條帶，超螺旋質(zhì)粒DNA ?泳動最快，其次為線狀DNA，開環(huán)質(zhì)粒DNA。
主要試劑
1. 重組pBS 質(zhì)料或pUC19 質(zhì)粒
2. EcoRI 酶及其酶切緩沖液
3. HindⅢ酶及其酶切緩沖液
4. 瓊脂糖(Agarose)
5. 5×TBE電泳緩沖液
6. 6×電泳載樣緩沖液：0.25％溴粉藍，40％(w/v) 蔗糖水溶液，貯存于 4℃。
7. 溴化乙錠(EB)溶液母液：將EB 配制成10mg/ml，用鋁箔或黑紙包裹容器，儲于室溫即可。
主要設(shè)備
1. 水平式電泳裝置
2. 電泳儀
3. 臺式高速離心機
4. 恒溫水浴鍋
5. 微量移液槍
6. 微波爐或電爐
7. 紫外透射儀
8. 照相支架
9. 照相機及其附件
實驗材料
自行提取純化的λDNA
實驗步驟
1. DNA酶切反應(yīng)
?? ?1) 將清潔干燥并經(jīng)滅菌的eppendorf 管(最好0.5ml)編號，用微量移液槍分別加入DNA ?1μg和相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶反應(yīng)10×緩沖液2μl，再加入重蒸水使總體積為19μl，將管內(nèi)溶液混勻后加入1μl ?酶液，用手指輕彈管壁使溶液混勻，也可用微量離心機甩一下，使溶液集中在管底。此步操作是整個實驗成敗的關(guān)鍵，要防止錯加，漏加。使用限制性內(nèi)切酶時應(yīng)盡量減少其離開冰箱的時間，以免活性降低。
?? 2) 混勻反應(yīng)體系后，將eppendorf 管置于適當(dāng)?shù)闹С治锷?如插在泡沫塑料板上)，37℃水浴保溫2-3 小時，使酶切反應(yīng)完全。
?? 3) 每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0)，混勻，以停止反應(yīng)，置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>2. DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)的制備
采用EcoRⅠ或HindⅢ酶解所得的λDNA片段來作為電泳時的分子量標(biāo)準(zhǔn)。λDNA ?為長度約50kb 的雙鏈DNA 分子，其商品溶液濃度為0.5mg/ml，酶解反應(yīng)操作如上述。HindIII切割 ?DNA后得到8個片段，長度分別為23.1，9.4，6.6，4.4，2.3，2.0，0.56 和0.12kb。EcoRI切割lDNA后得到6 ?個片段，長度分別為21.2，7.4，5.8，5.6，4.9和2.5kb。
3. 瓊脂糖凝膠的制備
?? 1) 取5×TBE緩沖液20ml加水至200ml，配制成0.5×TBE 稀釋緩沖液，待用。
?? ?2) 膠液的制備：稱取0.4g瓊脂糖，置于200ml 錐形瓶中，加入50ml ?0.5×TBE稀釋緩沖液，放入微波爐里(或電爐上)加熱至瓊脂糖全部熔化，取出搖勻，此為0.8％瓊脂糖凝膠液。加熱過程中要不時搖動，使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進入溶液。加熱時應(yīng)蓋上封口膜，以減少水份蒸發(fā)。
?? 3) 膠板的制備：將有機玻璃膠槽兩端分別用橡皮膏(寬約25px)緊密封住。將封好的膠槽置于水平支持物上，插上樣品梳子，注意觀察梳子齒下緣應(yīng)與膠槽底面保持1mm左右的間隙。
向冷卻至50-60℃的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠(EB)溶液使其終濃度為0.5μg ?/ml(也可不把EB 加入凝膠中，而是電泳后再用0.5μg/ml 的EB ?溶液浸泡染色)。用移液器吸取少量融化的瓊脂糖凝膠封橡皮膏內(nèi)側(cè)，待瓊脂糖溶液凝固后將剩余的瓊脂糖小心地倒入膠槽內(nèi)，使膠液形成均勻的膠層。倒膠時的溫度不可太低，否則凝固不均勻，速度也不可太快，否則容易出現(xiàn)氣泡。待膠完全凝固后撥出梳子，注意不要損傷梳底部的凝膠，然后向槽內(nèi)加入0.5×TBE ?稀釋緩沖液至液面恰好沒過膠板上表面。因邊緣效應(yīng)樣品槽附近會有一些隆起，阻礙緩沖液進入樣品槽中，所以要注意保證樣品槽中應(yīng)注滿緩沖液。
?? ?4) 加樣：取10μl酶解液與2μl 6×載樣液混勻，用微量移液槍小心加入樣品槽中。若DNA ?含量偏低，則可依上述比例增加上樣量，但總體積不可超過樣品槽容量。每加完一個樣品要更換tip ?頭，以防止互相污染，注意上樣時要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。
?? 5) 電泳：加完樣后，合上電泳槽蓋，立即接通電源?？刂齐妷罕３衷?0-80V，電流在40mA以上。當(dāng)溴酚藍條帶移動到距凝膠前沿約50px時，停止電泳。
?? 6) 染色：未加EB的膠板在電泳完畢后移入0.5μg/ml的EB溶液中，室溫下染色20-25分鐘。
?? ?7) 觀察和拍照：在波長為254nm ?的長波長紫外燈下觀察染色后的或已加有EB的電泳膠板。DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶。紫光燈下觀察時應(yīng)戴上防護眼鏡或有機玻璃面罩，以免損傷眼睛。經(jīng)照相機鏡頭加上近攝鏡片和紅色濾光片后將相機固定于照相架上，采用全色膠片，光圈5.6，曝光時間10-120秒(根據(jù)熒光條帶的深淺選擇)。
?? ?8) DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：在放大的電泳照片上，以樣品槽為起點，用卡尺測量λDNA ?的EcoRⅠ和HindⅢ酶切片段的遷移距離，以厘米為單位。以核苷酸數(shù)的常用對數(shù)為縱坐標(biāo)，以遷移距離為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出連結(jié)各點的平滑曲線，即為該電泳條件下DNA分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
?? ?9) DNA酶切片段大小的測定：在放大的電泳照片上，用卡尺量出DNA樣品各片段的遷移距離，根據(jù)此數(shù)值，在DNA ?分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的對數(shù)值，進一步計算出各片段的分子量大小(若用單對數(shù)坐標(biāo)紙來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，則可根據(jù)遷移距離直接查出DNA片段的大小)。反之，若已知DNA片段的大小亦可由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出它預(yù)計的遷移距離。
?? 10) DNA酶切片段排列順序的確定：根據(jù)單酶切，雙酶切和多酶切的電泳分析結(jié)果，對照DNA 酶切片段大小的數(shù)據(jù)進行邏輯推理，然后確定各酶切片段的排列順序和各酶切位點的相對位置。以環(huán)狀圖或直線圖表示，即成該DNA分子的限制性內(nèi)切酶圖譜。
注意事項
1. 酶切時所加的DNA溶液體積不能太大，否則DNA溶液中其他成分會干擾酶反應(yīng)。
2. ?酶活力通常用酶單位(U)表示，酶單位的定義是：在最適反應(yīng)條件下，1小時完全降解1mg lDNA 的酶量為一個單位，但是許多實驗制備的DNA ?不象lDNA那樣易于降解，需適當(dāng)增加酶的使用量。反應(yīng)液中加入過量的酶是不合適的，除考慮成本外，酶液中的微量雜質(zhì)可能干擾隨后的反應(yīng)。
3. 市場銷售的酶一般濃度很大，為節(jié)約起見，使用時可事先用酶反應(yīng)緩沖液(1×)進行稀釋。另外，酶通常保存在50%的甘油中，實驗中，應(yīng)將反應(yīng)液中甘油濃度控制在1/10 之下，否則，酶活性將受影響。
4. 觀察DNA離不開紫外透射儀，可是紫外光對DNA 分子有切割作用。從膠上回收DNA 時，應(yīng)盡量縮短光照時間并采用長波長紫外燈(300-360nm)，以減少紫外光切割DNA。
5. EB 是強誘變劑并有中等毒性，配制和使用時都應(yīng)戴手套，并且不要把EB 灑到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必須經(jīng)專門處理后才能清洗或丟棄。
6. 當(dāng)EB太多，膠染色過深，DNA帶看不清時，可將膠放入蒸餾水沖泡，30 分鐘后再觀察。
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技術(shù)原理
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