堿裂解法提取質(zhì)粒dna的原理
堿裂解或堿提取是分子生物學(xué)中用于從細(xì)菌中分離質(zhì)粒DNA的方法。
方法
首先，含有感興趣質(zhì)粒的細(xì)菌被培養(yǎng)，隨后通過(guò)離心濃縮細(xì)胞物質(zhì)（包括DNA）至容器底部形成一個(gè)沉淀物。上清液被棄去，然后將沉淀物重新懸浮在含有EDTA的生理緩沖液中。EDTA的作用是與二價(jià)金屬陽(yáng)離子如鎂離子和鈣離子結(jié)合，這些離子對(duì)于DNA降解酶（DNases）的功能至關(guān)重要，同時(shí)也有助于穩(wěn)定DNA磷酸基團(tuán)骨架和細(xì)胞壁。緩沖液中的葡萄糖將維持細(xì)胞的滲透壓，以防止細(xì)胞破裂。在緩沖液中加入三羥基尿素將保持細(xì)胞的pH值為8.0，而RNA酶將去除RNA，這將破壞實(shí)驗(yàn)。
此外，還準(zhǔn)備了一種強(qiáng)堿性溶液，該溶液由洗滌劑十二烷基硫酸鈉（SDS）和一種強(qiáng)堿如氫氧化鈉（NaOH）組成，并隨后加入。所得混合物經(jīng)過(guò)幾分鐘的培養(yǎng)。在此期間，洗滌劑破壞細(xì)胞膜，使堿性物質(zhì)能夠接觸并去折疊染色體和質(zhì)粒DNA。在SDS撕裂細(xì)胞膜后，細(xì)胞內(nèi)容物將中和氫氧化鈉；這就是為什么溶解pH值從12.8降至12.3的原因。因此，若細(xì)菌細(xì)胞數(shù)量不足，多余的氫氧化鈉將用于生成小的DNA片段。然而，0.5M L-精氨酸能夠提供穩(wěn)定的pH值，可用于替代0.1M的氫氧化鈉。
最后，加入醋酸鉀。此酸化溶液，使得質(zhì)粒DNA得以再溶，但不包括染色體DNA，后者會(huì)從溶液中沉淀出來(lái)。鉀的另一個(gè)功能是促使硫酸鈉十二烷基磺酸鹽的沉淀，從而去除洗滌劑。最終離心處理完成，這一次形成的沉淀物僅含有雜質(zhì)，可被丟棄。含有質(zhì)粒的上清液被小心地移除，可以進(jìn)一步純化或用于分析，如凝膠電泳。
其他用途
此外，有時(shí)還會(huì)使用堿性裂解法來(lái)提取植物遺傳物質(zhì)。植物細(xì)胞被置于一種強(qiáng)堿性溶液中，該溶液含有洗滌劑（通常為兩性或非離子型洗滌劑，如Tween 20），然后在高溫下進(jìn)行培養(yǎng)。由于氫氧化鈉對(duì)遺傳物質(zhì)的潛在損害性，使得該方法不常被采用，從而降低了DNA片段的大小。
堿裂解法提取質(zhì)粒dna的原理是：高PH的溶液會(huì)使細(xì)胞壁粕類從而使得DNA和蛋白質(zhì)變性。
將細(xì)菌懸浮液暴露于高pH值的強(qiáng)陰離子洗滌劑中，會(huì)使細(xì)胞壁破裂，染色體DNA和蛋白質(zhì)變性，將質(zhì)粒DNA釋放到上清中。
盡管堿性溶劑使堿基配對(duì)完全破壞，閉環(huán)的質(zhì)粒DNA雙鏈仍不會(huì)彼此分離，這因?yàn)樗鼈冊(cè)谕負(fù)鋵W(xué)上是相互纏繞的。只要用堿處理的強(qiáng)度和時(shí)間不要太過(guò)，當(dāng)pH值恢復(fù)到中性時(shí)，DNA雙鏈就會(huì)再次形成。
在裂解過(guò)程中，細(xì)菌蛋白質(zhì)、破裂的細(xì)胞壁和變性的染色體DNA會(huì)相互纏繞成大型復(fù)合物，后者被十二烷基硫酸鹽包蓋。當(dāng)用K+取代Na+時(shí)，復(fù)合物會(huì)從溶液中有效地沉淀下來(lái)，離心除去變性劑后，就可以從上清中回收復(fù)性的質(zhì)粒DNA。
在SDS存在的條件下，堿水解是一項(xiàng)非常靈活的技術(shù)，它對(duì)E. coli的所有菌株都適用，并且其細(xì)菌培養(yǎng)物的體積可以從1-500mL以上。
堿裂解法適用于小量質(zhì)粒DNA的提取，提取的質(zhì)粒DNA可直接用于酶切、PCR擴(kuò)增、銀染序列分析。方法如下：
1、接1%含質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞于2mlLB培養(yǎng)基。
2、37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。
3、取1.5ml菌體于Ep管(離心管)，以4000rpm離心3min，棄上清液。
4、加0.lml溶液I（1%葡萄糖，50mM/LEDTApH8.0，25mM/LTris-HClpH8.0）充分混合。
5、加入0.2ml溶液II（0.2mM/LNaOH，1%SDS），輕輕翻轉(zhuǎn)混勻，置于冰浴5min。
