液質(zhì)聯(lián)用中的質(zhì)譜——串聯(lián)質(zhì)譜篇（中）

2023.9.19

　　本文舉幾例常見的串聯(lián)質(zhì)譜儀，篇幅較長分為上、中、下三篇。

　　線性離子阱LIT/FTICR和LIT/Orbitrap

　　QqQ和QTOF都是串聯(lián)兩個(gè)“離子束”型分析器，近年來還有一種趨勢(shì)是串聯(lián)兩個(gè)離子捕獲型分析器，線性離子阱LIT/FTICR是此類最早的類型，由于維護(hù)困難，近年來慢慢被LIT/Orbitrap所取代。離子在不同質(zhì)量分析器間的傳輸，不是連續(xù)的離子束傳輸，而是先在LIT中累積，再以離子包的方式，用C-Trap傳輸?shù)絆rbitrap中。實(shí)驗(yàn)中，LIT和Orbitrap可以同時(shí)進(jìn)行質(zhì)量掃描，提升Duty Cycle和分析效率。

　　Orbitrap相對(duì)于FT-ICR的弱點(diǎn)是，Orbitrap在內(nèi)部無法碎裂離子，無法在Orbitrap分析器中直接進(jìn)行MSⁿ，而是等待前級(jí)傳來的碎片離子MSn，再進(jìn)行高分辨率分析。但Orbitrap除了維護(hù)簡(jiǎn)單，還有一些優(yōu)勢(shì)。兩者都是記錄像電流，放大后經(jīng)FT變換，因此靈敏度與信噪比相近，差異在于分辨率。對(duì)于ICR，分辨能力反比于質(zhì)荷比；對(duì)于Orbitrap，分辨能力反比于質(zhì)荷比的平方根，因此隨著質(zhì)荷比增加，Orbitrap的分辨能力比ICR下降更為緩和。小于m/z 300，ICR分辨能力高；大于m/z 300，在相同的檢測(cè)時(shí)間下，ICR分辨能力下降的幅度大于Orbitrap。超過m/z 4000后，ICR的分辨能力降到比Orbitrap更低。因此大分子分析中，Orbitrap更優(yōu)。

ICR與Orbitrap的分辨能力與質(zhì)量關(guān)系圖。兩種質(zhì)量分析器分辨能力均隨質(zhì)荷比增加而下降，而Orbitrap下降的幅度較ICR緩和，在更高質(zhì)荷比時(shí)分辨率優(yōu)于ICR

　　四極桿/軌道阱（Q/Orbitrap）以及三重串聯(lián)質(zhì)譜儀

　　四極桿和Orbitrap串聯(lián)時(shí)，主要利用設(shè)置于末端的高能碰撞解離（HCD）池執(zhí)行HCD模式。HCD專指Orbitrap類儀器中離子在高能碰撞池或多級(jí)離子通道中的碎裂方式，相比于CID碎裂方式能獲得低m/z的碎片離子，產(chǎn)生的碎片相對(duì)更多，譜圖質(zhì)量更高。Q/Orbitrap的最新型號(hào)如Orbitrap Exploris系列，體積緊湊可作為桌上型儀器。

Orbitrap Ascend Tribrid儀器示意圖

　　Orbitrap還可同時(shí)結(jié)合四極桿和線性離子阱成為三重串聯(lián)質(zhì)譜儀，如最新型號(hào)Orbitrap Ascend Tribrid，平臺(tái)的三重特性通過多種碎裂技術(shù)、多通路性（并行分析，即用一臺(tái)分析儀隔離離子，同時(shí)用另外兩臺(tái)分析儀進(jìn)行檢測(cè)）和同步母離子選擇 (SPS) 實(shí)現(xiàn)了功能擴(kuò)展。這里的C-Trap 有前置多級(jí)離子通道，用于離子儲(chǔ)存和MS2碎裂；還有后置多級(jí)離子通道。以蛋白質(zhì)組學(xué)定量實(shí)驗(yàn)為例，圖中所示綠、藍(lán)、黃色的不同離子正在同步進(jìn)行不同的運(yùn)動(dòng)。綠色離子先被選擇后到Orbitrap后獲得高分辨MS譜，然后經(jīng)前置多級(jí)離子通道HCD碎裂后送入LTQ后續(xù)的檢測(cè)器獲得MS/MS，又到LTQ獲得MS³，同時(shí)累積富集藍(lán)色離子；接下來將綠色離子的MS³送入Orbitrap獲得高分辨譜，同時(shí)將藍(lán)色離子做HCD碎裂，然后重復(fù)前面綠色離子的過程。圖中所示，當(dāng)富集黃色離子時(shí)，綠色離子將完成高分辨MS³，藍(lán)色離子的MS3正等待送入Orbitrap。

蛋白質(zhì)組學(xué)定量實(shí)驗(yàn)：TMTpro SPS MS³方法

　　Ascend上還具有CID、 ETD, UVPD, PTCR 和MSⁿ

　　HCD 等多種解離模式（后文會(huì)專門介紹各種解離模式）。將三個(gè)質(zhì)量分析器協(xié)同工作的模式，與不同的解離模式搭配，使Ascend Tribrid具有多種可以操控的組合模式。

　　2023年，賽默飛又推出了新型Orbitrap Astral質(zhì)譜儀，它也是一個(gè)三重串聯(lián)質(zhì)譜儀，包括四極桿、Orbitrap、Astral三個(gè)質(zhì)量分析器。Ascend中，LTQ的譜圖采集速度大概是50Hz，而Astral可以達(dá)到200Hz（每秒采集200張MS/MS譜）；同時(shí)Astral可以獲得8萬分辨率的MS/MS譜，只是Astral無法如LTQ再進(jìn)行MS³實(shí)驗(yàn)。未來，三個(gè)質(zhì)量分析器還可以通過協(xié)同工作，產(chǎn)生更多的實(shí)驗(yàn)流程。

Orbitrap Astral示意圖

　　離子淌度質(zhì)譜

　　離子淌度（Ion Mobility）有時(shí)譯為離子遷移，出現(xiàn)早期也被稱氣相電泳，可以獨(dú)立使用，也可以配合質(zhì)譜使用。最早的研究始于1950s，因其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、快速、靈敏、小巧便攜適于揮發(fā)物檢測(cè)，在安檢、化學(xué)武器、爆炸物與毒品檢測(cè)、在線檢測(cè)等領(lǐng)域，可獨(dú)立使用，原理與TOF類似，但不需要高真空。離子淌度的核心原理是電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)下離子在氣體阻尼環(huán)境中的遷移速率產(chǎn)生差異而分離。本文只介紹同質(zhì)譜配合使用的離子淌度。

　　一種應(yīng)用是安裝在質(zhì)譜儀的離子源與真空接口之間，使用氣相差分離子淌度來分離共洗脫化合物、同分異構(gòu)化合物以及隱藏在高背景噪聲中的化合物。其代表是SCIEX的SelexION技術(shù)和賽默飛的FAIMS技術(shù)。

　　SCIEX的離子淌度差分質(zhì)譜分離技術(shù)(Differential Mobility Spectrometry, DMS) 又叫差分離子淌度。SelexION DMS裝置由兩塊平行金屬電極（10×30mm，1mm間隔）構(gòu)成，置于curtain （離子源簾氣）和 orifice（采樣錐）之間，在大氣壓條件下工作，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單耐用，拆裝無需破壞質(zhì)譜真空系統(tǒng)。分離電壓 (SV) 垂直于輸送氣流的方向應(yīng)用至整個(gè)離子傳輸通道，由于高電場(chǎng)和低電場(chǎng)離子淌度系數(shù)之間的差異，離子向壁遷移并離開飛行路徑。它們的軌跡通過稱為補(bǔ)償電壓 (COV) 的平衡 DC 電壓校正。DMS 技術(shù)記錄在一定范圍的 SV 振幅下校正特定離子的軌跡所需的 COV。可以掃描 COV 以根據(jù)離子的差分淌度連續(xù)傳遞離子，或者將其設(shè)置為固定值以僅傳遞具有特定差分淌度的離子種類。

SelexION工作原理示意圖

　　DMS通過降低化學(xué)噪聲及預(yù)分離相似質(zhì)量的離子，提高質(zhì)量分析的質(zhì)量和定量準(zhǔn)確性。在 SV 和 COV 設(shè)置為零時(shí)允許無差別傳輸所有離子。DMS支持同時(shí)傳輸兩種極性的離子，并根據(jù)它們的差分淌度常數(shù)分別進(jìn)行分離。

　　FAIMS（High-Field Asymmetric Waveform Ion Mobility Spectrometry，高場(chǎng)非對(duì)稱波形離子遷移譜）和SelexION類似，只是兩電極由內(nèi)部圓柱電極、外部環(huán)電極組成，離子在電場(chǎng)的驅(qū)動(dòng)下繞過中心圓柱電極。工作時(shí)，離子在氣流的攜帶下移動(dòng)，在兩電極上加上兩組電壓：周期不對(duì)稱方波 DV 和補(bǔ)償電壓 CV。DV 是周期性的高/低電壓交替。由于高/低電壓所對(duì)應(yīng)的遷移率不同，離子會(huì)呈現(xiàn)鋸齒狀軌跡，且每個(gè)周期都會(huì)有一小段垂直方向上的位移。在此基礎(chǔ)之上，若疊加固定的補(bǔ)償電壓CV，則滿足特定差分遷移率（高場(chǎng)下遷移率與低場(chǎng)下遷移率的差值，因此 FAIMS 也叫差分離子淌度）的離子能夠平穩(wěn)地飛過電場(chǎng)，其它離子則會(huì)撞到極板上，這就實(shí)現(xiàn)了離子選擇。若隨時(shí)間改變CV即可實(shí)現(xiàn)對(duì)不同離子的掃描，電壓范圍一般為-50V~10V。

賽默飛FAIMS Pro Duo高場(chǎng)非對(duì)稱波形離子遷移譜

　　離子淌度的另一種應(yīng)用是在質(zhì)譜內(nèi)部，強(qiáng)調(diào)為傳統(tǒng)質(zhì)譜增加新的分離維度，提升信噪比，并可分辨同分異構(gòu)體、多電荷態(tài)。離子淌度質(zhì)譜自Waters 2006年推出SYNAPT 開始，在很多高端QTOF質(zhì)譜中配置，如安捷倫于2009年推出6540，布魯克于2016年推出timsTOF。離子淌度裝置的位置在離子傳輸Q0區(qū)或碰撞室Q2區(qū)，淌度分離是第一目標(biāo)，后來從timsTOF開始發(fā)現(xiàn)有富集離子的作用，在和TOF的脈沖配合后有提升Duty Cycle的作用，即在TOF脈沖進(jìn)樣的間隔富集離子，在進(jìn)樣時(shí)把所有的離子送入TOF。由于四極桿Q1是連續(xù)流傳輸離子的，所以淌度裝置在Q1前端Q0區(qū)和Q1后端Q2區(qū)都能發(fā)揮同樣的作用（當(dāng)然，如果不用淌度裝置，用阱類裝置也可以達(dá)到富集離子，提升Duty Cycle的效果）。

　　離子淌度使傳統(tǒng)質(zhì)譜除了按質(zhì)量和電荷數(shù)之外，還可以根據(jù)離子的尺寸和形狀分析樣品，為研究人員提供了傳統(tǒng)質(zhì)譜所不能獲取的特異性信息。該技術(shù)所獲取的4維數(shù)據(jù)信息，包括色譜保留時(shí)間、質(zhì)譜質(zhì)荷比、淌度漂移時(shí)間、離子強(qiáng)度。通過軟件能夠?qū)ζ渲械娜我舛S或三維信息進(jìn)行自由選取或可視化處理。

安捷倫6560離子淌度QTOF示意圖

　　安捷倫2021年最新的6560C離子淌度QTOF的工作原理為：入口離子漏斗聚焦，進(jìn)入捕集漏斗，累積一定量離子后，打開ion gate，向漂移管（約80cm長）注入離子。離子依次通過漂移管，進(jìn)入出口離子漏斗，再次聚焦，進(jìn)入后級(jí)Q1四極桿。使用安捷倫高分辨率多重性分解 (HRdm 2.0) 軟件進(jìn)行后處理，可實(shí)現(xiàn)高達(dá) 200 的全譜離子淌度分辨率。

　　沃特世有獨(dú)特的各種“Wave“技術(shù)，用于Q0和碰撞室，如ScanWave，StepWave，Travelling-Wave行波（簡(jiǎn)稱T-Wave）技術(shù)等，主要是為了提升傳輸效率。T-Wave技術(shù)用于QTOF碰撞室，在原有碰撞室氣體的基礎(chǔ)上加更多的氣體，由于不同尺寸大小的離子碰撞截面積不同，阻力也不同，因此能把不同形態(tài)的離子分開，即離子淌度。沃特世在2006年推出高清質(zhì)譜SYNAPT HDMS，目前最新型號(hào)為SYNAPT XS。

沃特世SYNAPT系列離子淌度QTOF示意圖

　　首先離子在TRAP T-Wave中蓄積，然后被釋放到IMS T-Wave中，完成離子分離。隨后離子通過TRANSFER T-Wave 傳輸至質(zhì)量分析器。其工作周期約幾十毫秒。注意，IMS離子淌度分離發(fā)生在Q1后的碰撞池中。2015年，沃特世還推出了VION，和6560類似，淌度池在離子源和Q1之間的Q0區(qū)。

　　2019年沃特世發(fā)布了環(huán)形淌度 SELECT SERIES Cyclic IMS ，用緊湊型環(huán)形離子導(dǎo)向裝置替代傳統(tǒng)的線性離子淌度區(qū)域，可以控制離子進(jìn)行一圈或多圈的淌度分離，淌度分辨率可從單圈的65提升到多圈的400，甚至有研究報(bào)道至100圈時(shí)可獲得750的淌度分辨率。鍍金電極陣列固定于PCB板上，多功能T-WAVE 陣列控制離子多種模式，除了可以根據(jù)選擇做多圈的淌度分離后送入TOF，還可以從離子組合中選擇并分離出某個(gè)離子，并以CID活化重新注入，進(jìn)而可獲得IMSn（n最多為5級(jí)）。

沃特世SELECT SERIES Cyclic IMS環(huán)形淌度質(zhì)譜儀示意圖

　　2016年，Bruker推出timsTOF，淌度分辨率從原來市場(chǎng)上的40 提升到近200，關(guān)鍵技術(shù)是TIMS (Trapped Ion Mobility Spectrometry) 捕集離子淌度，其位置在Q1前。

TIMS原理示意圖

　　氣流攜帶離子進(jìn)入逆向梯度電場(chǎng)（像一個(gè)加了坡度的跑步機(jī)），若氣流速度與離子的遷移速率相等則離子相對(duì)于漂移管靜止，即不同離子依其淌度差異，分布在不同電場(chǎng)強(qiáng)度的位置。離子截面越大，離子淌度越小，維持靜止所需的電場(chǎng)強(qiáng)度越高，即穩(wěn)定在高場(chǎng)區(qū)域。此時(shí)若逐漸降低電壓，即實(shí)現(xiàn)掃描。若改變電場(chǎng)梯度分布還可選擇性釋放出單一淌度值的離子，即SA-TIMS (selected accumulation-TIMS)。其工作氣壓約0.2 ~ 0.5 KPa。傳統(tǒng)的2米長的遷移管，分辨率約等于80左右；而只需要一個(gè)5厘米長的TIMS部件，由于流速可調(diào)，將流速增加至漂移距離約等于10米，R即可約等于180。

　　隨后，布魯克推出了雙TIMS的timsTOF Pro和隨后的系列，并和Matthias Mann合作發(fā)布Parallel Accumulation–Serial Fragmentation (PASEF) 平行累積連續(xù)碎裂技術(shù)。它使用了兩組 TIMS，離子在第一個(gè)TIMS部分中進(jìn)行累積，然后進(jìn)入第二個(gè)TIMS完成淌度分離，分離后的離子繼續(xù)MS/MS碎裂，隨后重復(fù)該步驟。而在PASEF過程中，當(dāng)?shù)诙€(gè)TIMS進(jìn)行分離時(shí)，第一個(gè)TIMS也同時(shí)在平行地累積離子，這樣可以實(shí)現(xiàn)近乎100％的離子利用率。對(duì)于蛋白質(zhì)組學(xué)來說，大幅提升靈敏度和序列覆蓋率；同時(shí)結(jié)合了離子淌度的4D分離技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)碰撞橫截面（ CCS ）的分析，也在蛋白質(zhì)組學(xué)的相關(guān)應(yīng)用中發(fā)揮了巨大作用。