分子生物學蛋白質(zhì)磷酸化分析技術
在所 有 的 翻譯后修飾中，可逆的磷酸化，幾乎調(diào)節(jié)著生命活動的整個過程，包括細胞的增殖、發(fā)育和分化，神
經(jīng)活動，肌肉收縮，新陳代謝，腫瘤發(fā)生等。據(jù)統(tǒng)計，哺乳動物細胞內(nèi)有三分之一以上的蛋白質(zhì)可以被磷酸化川，蛋白質(zhì)的可逆磷酸化使得蛋白質(zhì)組學研究更為復雜。 真核 生 物 細胞蛋白質(zhì)中主要的磷酸化氨基酸為
絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸，其比例大概為1800:200:11 21。大多數(shù)磷酸化蛋白質(zhì)都有多個磷酸化位點，并且其磷酸化位點是可變的。因此，一種蛋白可能有多種磷酸化形式。雖然對磷酸化蛋白質(zhì)組學分析已有很大進步，但依然存在多個難點19待解決包括磷酸化蛋白和膚段的富集，可逆性磷酸化位點的鑒定以及磷酸化位點的定量等。1 磷酸化蛋白的識別
磷 酸 化 蛋白在細胞中含量甚微。在質(zhì)譜分析中，磷酸化肚段的信號往往被非磷酸化膚段的信號所抑制。因而磷酸化蛋白和膚段的富集在提高磷酸化 位點的檢測中占有非常重要的地位。
1. 1 磷酸化蛋白的富集
過 去 關 于 磷 酸化蛋白富集的方法主要應用針對特 定蛋白的抗體進行免疫沉淀。但該法需要首先對
蛋 白有所了解，且不適合大規(guī)模研究。雖然，近來關 于針對磷酸化基團的抗體已經(jīng)出現(xiàn)，但只有抗磷
酸化酪氨酸的抗體效果較好[41。而抗磷酸化絲氨酸 、蘇氨酸的抗體特異性均不強。近來，商品化的
磷 酸化蛋白提純和富集試劑盒，在酵母中已成功應用，但在其它組織的應用還未見報道川。
1.2 磷酸化蛋白膠染色
檢測 蛋 白 混合物中磷酸化蛋白的經(jīng)典方法是先
行電泳分離蛋白質(zhì)，然后用放射自顯影術或針對磷
酸化蛋白的免疫印記方法來檢測。近來，Pro-Q Diaround
磷酸化蛋白膠染色是一項重大的技術突
。破b]。這種特殊的熒光染料可以直接在膠內(nèi)檢測
針對磷酸化絲氨酸、蘇氮酸和酪氨酸的蛋白，而不
需特殊的抗體或同位素標記。這種染色適用于
SDS-聚丙烯酸胺凝膠和二維聚丙烯酞胺凝膠，并旦
這種染色和后續(xù)的質(zhì)譜鑒定是完全兼容的。SYPRO
Ruby染色是針對總蛋白的染色。通過每條泳帶或
每個點的Pro-Q Diamond染色和SYPRO Ruby染色
的比值，可以了解磷酸化蛋白在總蛋白中的比值。
兩種蛋白染色結(jié)合使用，可以將高豐度蛋白的低磷
酸化狀態(tài)與低豐度蛋白的高磷酸化狀態(tài)區(qū)分開
2 磷酸化膚段的富集
磷酸 化 位 點的檢測往往不是直接從蛋白水平檢
測，而是從膚段水平檢測。但由于L述提到的抑制
現(xiàn)象的存在，在分析之前應首先對磷酸化膚段進行
富集。
2.1 固定金屬親和色譜
目前 使 用 最廣泛的分離和富集磷酸化肚段的方
法是固定金屬親合色譜(immobilized metal affinity
chromatography, IMAC)。此方法中，鍵合在鰲合
底物上的金屬離子(如Fe3. , Gas. , Cue'等)選
擇性地與磷酸化臉中的磷酸基團結(jié)合，在高pH值
或磷酸鹽緩沖液中磷酸化膚可以釋放出來。洗脫下
來的溶液經(jīng)脫鹽處理后可直接用于質(zhì)譜分析。
IMAC通?？筛患搅姿峄睦野彼?、絲氮酸和蘇
氨酸殘基。但這種方法的局限性在于:可熊會丟失
掉一些低豐度的沒有結(jié)合到IMAC柱上的磷酸化膚
段;具有多磷酸化位點的膚由于其較強的親和力很
難被洗脫下來;某些酸性基團(如天冬氨酸和谷氨
酸)、電子供體文如組氨酸)也會結(jié)合到柱上·，造
成非磷酸化膚的污染。所以用IMAC方法富集磷酸
化膚的效果如何，絕大部分依賴于所選擇的金屬離
子、填充柱的材料、及洗脫的程序。最近，F(xiàn)icarro
等[C1在IMAC富集以前，將膚的酸性殘基進行酷化
處理，使其特異性大大提高，預期對大范圍磷酸化
分析具有廣闊的前景。
2.2 磷酸化肚段的化學修飾
近來 ， O da等[1-1將膚或蛋白混合物置于堿性硫
代二乙醇溶液中，通過P2消除從磷酸化絲氨酸或
蘇氨酸中去掉磷酸基團H3P0 ,，形成的雙鍵受到硫
代二乙醇的作用，琉基取代磷酸根。生物素與琉基
相連，被標記的膚或蛋白質(zhì)上樣于固定有親和素的
層析柱，通過生物素與親和素的高親和力作用而達
到磷酸化膚或蛋白質(zhì)富集的目的。這一方法的主要
缺點在于它不能富集酪氨酸磷酸化的蛋白質(zhì)和膚。
Zhou等I〕用另外一種方法修飾磷酸化骯，用碳二
亞胺濃縮反應將半朧氨酸加在磷酸鹽部分，修飾過
的膚段以共價鍵與碘乙酞胺樹脂結(jié)合，酸洗滌釋
放。此方法既可用于富集磷酸化酪氨酸也可用于富
集磷酸化絲氨酸和磷酸化蘇氨酸，但需要許多步化
學反應和柱純化過程。
