多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR技術(shù)）
多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)即PCR（polymerase chain reaction）技術(shù)，應(yīng)用這一技術(shù)可以將微量目的基因（DNA片段）擴(kuò)增一百萬倍以上。
PCR反應(yīng)理論的提出和技術(shù)的完善對于分子生物學(xué)的發(fā)展具有特殊的意義，它以敏感度高、特異性強(qiáng)、產(chǎn)率高、重復(fù)性好以及快速簡便等優(yōu)點(diǎn)迅速成為分子生物學(xué)研究中應(yīng)用最為廣泛的方法之一，并使得很多以往無法解決的分子生物學(xué)研究難題得以解決。發(fā)明這一技術(shù)的K. Mullis因此貢獻(xiàn)而獲得了1993年度諾貝爾化學(xué)獎。
一、PCR技術(shù)的工作原理
PCR的基本工作原理是以擬擴(kuò)增的DNA分子為模板，以一對分別與模板5'末端和3'末端互補(bǔ)的寡核苷酸片段為引物（primer），在耐熱DNA聚合酶的作用下，按照半保留復(fù)制的機(jī)制沿著模板鏈延伸直至完成新的DNA分子合成。重復(fù)這一過程，即可使目的DNA片段得以大量擴(kuò)增。
組成PCR反應(yīng)體系的基本成分包括：模板DNA、特異性引物、耐熱DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）、dNTP以及含Mg2＋的緩沖液。
PCR的基本反應(yīng)步驟包括：
?。?）變性：將反應(yīng)體系加熱至 95℃，使模板DNA完全變性成為單鏈，同時引物自身以及引物之間存在的局部雙鏈也得以打開；
（2）退火：將溫度下降至適宜溫度使引物與模板DNA退火結(jié)合；
?。?）延伸：將溫度升至72℃，耐熱DNA聚合酶發(fā)揮酶活性，以dNTP為底物催化DNA的合成反應(yīng)。上述三個步驟構(gòu)成一個循環(huán)，新合成的DNA分子繼續(xù)作為下一輪合成的模板，經(jīng)多次循環(huán)（25～30次）后即可達(dá)到擴(kuò)增DNA片段的目的。
二、PCR引物的設(shè)計
PCR反應(yīng)成功的一個關(guān)鍵條件是正確設(shè)計引物。好的引物設(shè)計可以避免非特異產(chǎn)物的產(chǎn)生，也極大地影響著擴(kuò)增產(chǎn)量。當(dāng)然，有了好的引物，依然需要進(jìn)行反應(yīng)條件的優(yōu)化。然而如果不遵守引物設(shè)計的基本規(guī)則，即使改變反應(yīng)條件也不會有什么好效果。
引物設(shè)計需要在擴(kuò)增特異性和擴(kuò)增效率兩方面目標(biāo)上取得平衡。目前，可利用計算機(jī)軟件方便地進(jìn)行引物設(shè)計，引物設(shè)計軟件會通過每一引物設(shè)計變化的預(yù)定值在兩個目標(biāo)間取得平衡，找出最佳引物。
不過，我們也須根據(jù)實(shí)驗具體要求進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整（如在醫(yī)學(xué)診斷中，可以以犧牲效率為代價調(diào)整引物以提高特異性，因為在臨床診斷中避免假陽性比產(chǎn)生大量擴(kuò)增產(chǎn)物更重要）。以下是引物設(shè)計的幾項基本原則。
1. 引物長度
在16～40 bp范圍內(nèi)，以18～24 bp最佳。引物過短，會降低產(chǎn)物的特異性，每增加一個核苷酸，引物特異性可以提高4倍。注意，這里引物的長度是指與模板DNA序列互補(bǔ)的部分，并不包括為后續(xù)克隆而加的酶切位點(diǎn)等額外序列。引物過長，會使退火過程不完全，與模板結(jié)合不充分，以至引起擴(kuò)增產(chǎn)物的明顯減少。
2. 引物末端
引物的3'末端對PCR反應(yīng)是非常關(guān)鍵的。由于引物3'端的第一和第二個堿基影響Taq DNA聚合酶的延伸效率，因而會影響PCR反應(yīng)的擴(kuò)增效率及特異性。引物的最好選T、G、C而不選A；同時，引物的3'端應(yīng)該為保守氨基酸序列，即采用簡并密碼少的氨基酸如Met、Trp，且要避免密碼子第三個堿基的擺動位置位于引物的3'端。
對于引物5'末端的堿基并無嚴(yán)格限制。當(dāng)引物長度足夠時，引物5'端的堿基可不與模板DNA互補(bǔ)結(jié)合而呈游離狀態(tài)。因此可在引物5'端加限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)、啟動子或其他序列等，以便于PCR產(chǎn)物的分析、克隆。引物5'端最多可加到10個堿基而對PCR反應(yīng)無影響。
一對引物之間可能存在互補(bǔ)序列，特別是3'末端應(yīng)盡量避免互補(bǔ)，以免形成“引物二聚體”造成引物浪費(fèi)和非特異擴(kuò)增。每一個引物的內(nèi)部也應(yīng)盡量避免形成二級結(jié)構(gòu)，特別是引物的末端應(yīng)無回文結(jié)構(gòu)。
3. 引物G＋C含量和Tm值
引物G＋C含量應(yīng)該保持在40%～75%之間。G＋C含量50%的20個堿基寡核苷酸鏈的Tm值約在56℃～62℃范圍內(nèi)。在此范圍內(nèi)，既可以保證有效退火，又維持了良好的特異性。一般引物設(shè)計軟件在核苷酸序列確定后即可算出引物的Tm值、檢查有無引物二聚體以及回文結(jié)構(gòu)等。
4. 引物的位置
引物的序列應(yīng)位于基因組DNA中的保守區(qū)，且與非擴(kuò)增區(qū)無同源序列，這樣可以減少引物與基因組的非特異結(jié)合，提高反應(yīng)特異性。若是以cDNA為模板，則首先應(yīng)盡力使引物和產(chǎn)物保持在mRNA的編碼區(qū)域內(nèi)。其次，盡量把引物放到不同的外顯子上，以便使特異PCR產(chǎn)物與從污染DNA中產(chǎn)生的產(chǎn)物在大小上相區(qū)別。
三、PCR的基本操作步驟及條件優(yōu)化
1. 基本操作步驟
PCR反應(yīng)基本步驟是在反應(yīng)管中加入PCR反應(yīng)緩沖液、dNTP、引物、DNA模板和耐熱DNA聚合酶，混勻后加石蠟油封蓋防止反應(yīng)液的揮發(fā)（目前有些PCR儀在無特殊要求時可不用石蠟油封），然后將反應(yīng)管置于PCR儀中開始以下循環(huán)反應(yīng)：
?、僮冃裕―enature）：模板DNA在95℃左右的高溫條件下氫鍵斷裂，雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA并游離于反應(yīng)液中。
?、谕嘶穑ˋnnealing）：人工合成的兩條寡核苷酸引物在適當(dāng)溫度下分別與模板DNA擴(kuò)增區(qū)域的兩端按堿基互補(bǔ)配對結(jié)合，此時，DNA聚合酶便可開始合成新鏈。由于添加的引物分子數(shù)遠(yuǎn)大于模板DNA的分子數(shù)，因此引物與模板DNA形成復(fù)合物的幾率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于DNA分子自身的復(fù)性。
?、垩由欤‥xtension）：在4種dNTP底物及Mg2+存在的條件下，耐熱DNA聚合酶在最適溫度下將單核苷酸按堿基互補(bǔ)配對原則從引物的3'端摻入，使引物沿5'→3'方向延伸合成新股DNA。每一循環(huán)的產(chǎn)物再作為下一循環(huán)的模板。
整個PCR反應(yīng)一般須進(jìn)行30輪的循環(huán)。在最初的循環(huán)階段，原來的DNA鏈起著模板的作用，隨著循環(huán)次數(shù)增加，新合成的引物延伸鏈急劇增多而成為主要模板，因此PCR擴(kuò)增產(chǎn)物將受到所加引物5'末端的限制，使終產(chǎn)物序列介于兩種引物5'末端之間的區(qū)域。
2. 條件優(yōu)化
PCR方法操作簡便，但影響因素頗多，因此需要根據(jù)不同的目的及不同的DNA模板，探索最適條件，以獲得最佳反應(yīng)結(jié)果。以下主要從反應(yīng)的特異性、敏感性、忠實(shí)性及擴(kuò)增效率等四個方面討論P(yáng)CR反應(yīng)條件的優(yōu)化。
?。?）PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：
?、僮冃裕鹤冃詼囟冗^高或變性時間過長都會導(dǎo)致耐熱DNA聚合酶活性的喪失，從而影響PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。但變性溫度過低或變性時間過短則會導(dǎo)致DNA模板變性不完全，使引物無法與模板結(jié)合，同樣會導(dǎo)致PCR反應(yīng)的失敗。通常情況下，95℃變性20～30 s即可使各種DNA分子完全變性。
?、谕嘶穑阂锱c模板的退火溫度由引物的長度及G＋C含量決定。退火溫度一般應(yīng)比Tm值低3℃～12℃（5℃為宜，但不應(yīng)超出15℃）。增加退火溫度可減少引物與模板的非特異結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性；降低退火溫度則可增加PCR反應(yīng)的敏感性。退火時間一般為20～40 s，時間過短會導(dǎo)致延伸失??；時間過長則易產(chǎn)生引物二聚體或?qū)е路翘禺愋耘鋵Α?/p>
③延伸：延伸溫度取決于所用耐熱DNA聚合酶的最適溫度，通常為70℃～75℃，一般不隨意更改。延伸時間取決于擴(kuò)增片段的長度：目的片段小于500 bp時，延伸時間為20 s；目的片段在500～1200 bp時，延伸時間需40 s；目的片段大于1200 bp則還需增加延伸時間。另外，還可以500 bp/30 s為基準(zhǔn)，根據(jù)目的片段長度計算反應(yīng)時間。目的片段小于150 bp時甚至可以省略延伸步驟，因為退火溫度下DNA聚合酶的活性已足以完成短序列合成。
?、苎h(huán)次數(shù)：主要取決于模板DNA濃度，一般為25～35次，此時PCR產(chǎn)物的積累即可達(dá)到最大值。在得到足夠產(chǎn)物的前提下應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù)。
?。?）反應(yīng)增強(qiáng)劑：PCR反應(yīng)中加入一定濃度的增強(qiáng)劑如1%～10%二甲基亞砜（DMSO）、5%～20%甘油、非離子去污劑、1.25%～10%甲酰胺和10～100 μg/ml牛血清白蛋白等可提高反應(yīng)特異性和產(chǎn)量，有些反應(yīng)只能在這些輔助劑存在時才能進(jìn)行。
?。?）熱啟動PCR：如果PCR反應(yīng)混合物置于低于Tm值溫度時，會在極短時間內(nèi)產(chǎn)生引物二聚體和非特異性配對，而熱啟動PCR方法則可大大減少這種情況的發(fā)生。具體方法是：先將PCR反應(yīng)體系升溫至95℃，預(yù)變性2～5 min后，將儀器設(shè)在暫停，在這一高溫條件下迅速加入耐熱DNA聚合酶后再恢復(fù)循環(huán)。熱啟動可以防止模板變性不充分，同時還避免了耐熱DNA聚合酶活性的迅速下降。
四、PCR技術(shù)的主要用途
1. 目的基因的克隆
PCR技術(shù)為在重組DNA過程中獲得的目的基因片段提供了簡便快速的擴(kuò)增方法。該技術(shù)可用于：
?、倥c逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)相結(jié)合，可以直接從組織和細(xì)胞的mRNA獲得目的基因片段；
?、诶锰禺愋砸镆詂DNA或基因組DNA為模板獲得已知目的基因片段；
?、劾煤啿⒁飶腸DNA文庫或基因組文庫中提取具有一定序列相似性的基因片段；
?、芾秒S機(jī)引物從cDNA文庫或基因組文庫中克隆基因。
2. 基因的體外突變
利用PCR技術(shù)可以隨意設(shè)計引物在體外對目的基因片段進(jìn)行嵌和、缺失、點(diǎn)突變等改造。
3. DNA和RNA微量分析
PCR技術(shù)高度敏感，對模板DNA的含量要求很低，是DNA和RNA（RNA一般需要先逆轉(zhuǎn)錄成為cDNA）微量分析的好方法。從理論上講，只要存在1分子模板，就可以獲得目的片段。在實(shí)際工作中，一滴血、一根毛發(fā)或一個細(xì)胞就足以滿足PCR的檢測需要。因此，PCR在基因診斷方面具有極廣闊的應(yīng)用價值。
4. DNA序列測定
將PCR技術(shù)引入DNA序列測定，可使測序工作大為簡化，也提高了測序的速度。待測DNA片段既可以克隆到特定的載體后進(jìn)行序列測定，也可直接測定。
5. 基因突變分析
基因突變可引起許多遺傳病、免疫性疾病和腫瘤等，故分析基因突變可以為這些疾病的診斷、治療和研究提供重要的依據(jù)。利用PCR與一些技術(shù)的結(jié)合可以大大提高基因突變檢測的敏感性。
五、幾種重要的衍生PCR技術(shù)
PCR技術(shù)的發(fā)展以及和已有分子生物學(xué)技術(shù)的結(jié)合形成了多種PCR衍生技術(shù)，大大提高了PCR反應(yīng)的特異性和應(yīng)用的廣泛性?，F(xiàn)僅舉幾例介紹與醫(yī)學(xué)研究密切相關(guān)的PCR衍生技術(shù)。
1. 逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)
逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription PCR, RT-PCR）是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)聯(lián)合應(yīng)用的一種技術(shù)。即首先以RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA，然后再以cDNA為模板通過PCR反應(yīng)來擴(kuò)增目的基因。RT-PCR是目前從各種組織或細(xì)胞中獲得目的基因以及對已知序列的RNA進(jìn)行定性和/或定量分析的最有效方法之一，具有敏感度高、特異性強(qiáng)和省時等優(yōu)點(diǎn)。
2. 原位PCR技術(shù)
原位PCR（in situ PCR, ISP）是在福爾馬林固定、石蠟包埋的組織切片或細(xì)胞涂片上的單個細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的PCR反應(yīng)，然后用特異性探針進(jìn)行原位雜交，即可檢出待測DNA或RNA是否在該組織或細(xì)胞中存在。原位PCR方法彌補(bǔ)了PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)的不足，是將目的基因的擴(kuò)增與定位相結(jié)合的一種好方法。
3. 實(shí)時PCR技術(shù)
實(shí)時PCR（real time PCR）技術(shù)是近年發(fā)展起來的一種新的核酸微量分析技術(shù)，尤其是在定量RT-PCR中具有重要的價值。
實(shí)時PCR的基本原理是引入了熒光標(biāo)記分子，使在PCR反應(yīng)中產(chǎn)生的熒光信號與PCR產(chǎn)物的量成正比，對每一反應(yīng)時刻的熒光信號進(jìn)行實(shí)時分析，便可計算出PCR產(chǎn)物的量。根據(jù)動態(tài)變化數(shù)據(jù)，可以精確計算出樣品中原有模板的含量。
與傳統(tǒng)PCR反應(yīng)相比，在常規(guī)的正向和反向PCR引物之間增加了一對特殊的引物作為探針，探針的5'端有一個熒光報告分子（reporter, R），3'端有一個熒光淬滅分子（quencher, Q）。
沒有擴(kuò)增反應(yīng)時，探針保持完整，熒光報告分子和熒光淬滅分子同時存在于探針上，于是熒光信號被淬滅，無熒光信號釋放。隨著PCR的進(jìn)行，Taq DNA聚合酶在鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合著的熒光探針，其5′→3′外切核酸酶活性就會將該探針逐步切斷，報告熒光基團(tuán)一旦與淬滅基團(tuán)分離，便產(chǎn)生熒光信號。后者被熒光監(jiān)測系統(tǒng)接收，用于數(shù)據(jù)分析。實(shí)時PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了PCR反應(yīng)從定性到定量的飛躍，目前已逐步得到廣泛的應(yīng)用。
-
綜述
