estern Blot（WB）可以說是生物學方向的同學最...最基本的實驗技能了，然而好看的 WB 總是別人的，自己的 WB 總是雜帶叢生，尤其是新課題、新抗體，總在目的條帶附近出現(xiàn)非特異性條帶。產(chǎn)生這種狀況的原因是什么呢、用下面的幾個例子，咱們一起研究一下。
案例一：啥也沒有
原因：比較多，如果單純一張沒有任何顯色的X光片，最可能是一抗加成其他抗體，或者二抗種屬加錯了，比如兔的加成鼠的。
解決辦法：仔細檢查抗體是否加錯，確認轉(zhuǎn)膜沒有問題。
經(jīng)驗：上面的圖片展示的是一點信號都沒有，如果是這樣大部分情況是抗體加錯了。如果中間出現(xiàn)了細微的條帶，可能原因是蛋白上樣量太少，一抗?jié)舛冗^低，ECL發(fā)光液失效。另外如果轉(zhuǎn)膜出現(xiàn)了問題，比如膜放反了，自然是一個白片。
案例二：高背景
原因：封閉不夠好，一抗?jié)舛雀?，洗膜時間和次數(shù)不夠
解決辦法：降低一抗?jié)舛龋黾酉茨r間和次數(shù)。
經(jīng)驗：高背景可能是WB中最常見出現(xiàn)的問題，目的條帶單一清晰，但是其他地方又彌漫性較為均一的背景（比較連續(xù)的）。其實只要我們注意操作規(guī)范，不偷工減料就很容易避免，洗膜按照規(guī)定來5min*5次或者10min*3次，不要改成5min*3次，或者10min*2次。
案例三：非特異性條帶
原因：一抗非特異性與蛋白結(jié)合
解決辦法：更換一抗
經(jīng)驗：此種情況絕大多數(shù)是因為一抗不好，你無法判斷那一條是目的條帶。如果實在沒有更好的抗體，建議采用陰性對照和陽性對照來確定上述哪個條帶是目的條帶。當然這種情況下有一種很小幾率的可能是一抗?jié)舛忍咭鸬姆翘禺愋越Y(jié)合。
案例四：條帶中出現(xiàn)邊緣規(guī)則的白圈
原因：電轉(zhuǎn)中膜和膠之間存在氣泡。
解決辦法：轉(zhuǎn)膜前去掉膜和膠之間的氣泡
經(jīng)驗：我們常常將電轉(zhuǎn)液倒入一個盤子里，倒入的液體不能太多也不能太少，最好的高度是與放上第一層濾紙齊平，然后往濾紙上澆點轉(zhuǎn)膜液，把電泳膠用清水清洗下，將電泳膠平鋪到濾紙上，仔細檢查濾紙與膠之間是否有氣泡，可以左右前后觀察，不同方向觀察之后確認無氣泡。
然后再往膠上面澆點電轉(zhuǎn)液，用兩只手的拇指和食指輕輕夾住PVDF膜的兩側(cè)中間，使膜成U型，然后將U型的底部接觸膠的中間，慢慢往兩邊放下膜，這樣一般氣泡很少。然后上層濾紙同樣用U型的放置方法，用玻璃棒稍微貼實下，然后蓋上海綿。注意不要來回趕氣泡，這樣反而會帶入氣泡。
案例五：條帶中間出現(xiàn)白色（反白）
原因：中心部位高濃度HRP把底物消耗過快，中間部位底物消耗結(jié)束之后就不發(fā)光了
解決辦法：降低蛋白量，降低一抗和二抗的濃度。
經(jīng)驗：如果你足夠迅速，可以在中間部位底物消耗之前就把X光片給定影出來，但是時間很難把握，建議還是從降低蛋白量，降低一抗二抗?jié)舛热胧帧?
其他問題
（1）蛋白分子量偏高或者偏低。可能是膠的濃度與目的蛋白的濃度不對應(yīng)，比如說100KD的蛋白你用12%的膠跑，或者說20KD的蛋白你用6%的膠跑。
（2）蛋白質(zhì)降解。蛋白質(zhì)降解后很可能會在比原來位置低的地方出現(xiàn)主帶，然后會出現(xiàn)一些其他帶，最主要特點是所有的條帶比正常的都低，并且條帶模糊不清晰。
?。?）所有條帶連成一片沒有間隔。原因最可能是上樣量過多，其次是樣品彌散（比如電泳長時間停止樣品彌散）。
產(chǎn)生上述現(xiàn)象的時候，不妨先思考幾個問題：
你的樣品類型是組織還是細胞？
如果是組織，提取物會傾向于有較高的背景和降解條帶。
如果是細胞，傳代是在 15 代以內(nèi)還是 15 代以上？
細胞系是否新鮮，有沒有加蛋白酶/磷酸酶抑制劑和超聲處理？
思考完這些問題，我們一起再從九個方面詳細分析一下，哪些因素會導致你的結(jié)果出現(xiàn)多條非特異性條帶：
-1-
原因：細胞系傳代次數(shù)過多，蛋白表達譜發(fā)生變化。
建議：使用未傳代或傳代次數(shù)較少的細胞系（不超過 15 代）進行樣品制備。
-2-
原因：與細胞系裂解物相比，原代細胞或組織提取物會傾向于有較高的背景和降解條帶。
建議：用新鮮提取的，經(jīng)過超聲處理的澄清的組織提取物能降低背景；
同時，用去垢劑含量較高的 RIPA buffer 裂解組織，可得到裂解更徹底、一致性更高的裂解物。
-3-
原因：蛋白被降解。
建議：
提取液確保含有蛋白酶抑制劑，并超聲；
蛋白樣品提取后分裝－20 ℃ 或－80 ℃ 短期保存，避免反復凍融，有條件盡量用新鮮提取的蛋白。
-4-
原因：蛋白本身有很多修飾。
建議：查閱文獻，確定目的蛋白是否存在多種修飾，泛素化、糖基化等修飾會讓蛋白的條帶發(fā)生較大的偏移。
-5-
原因：所檢測蛋白存在多種剪接體，導致分子量大小不同。
建議：查閱文獻或者通過搜索數(shù)據(jù)庫來確定該蛋白是否存在多種長度不同的編碼 mRNA。
-6-
原因：蛋白存在二聚體或多聚體。
建議：SDS loading buffer 中現(xiàn)用現(xiàn)加 β－巰基乙醇或 DTT。
-7-
原因：樣本存在外源轉(zhuǎn)入蛋白。
建議：檢查所用樣本是否有過被外源進去帶有標簽的靶標蛋白。如有，更換細胞系樣本。
-8-
原因：上樣量過多。
建議：根據(jù)靶標表達情況，梯度上樣跑膠后選擇合適的上樣量，通常 20~50 μg 即可。
-9-
原因：實驗操作與 CST 推薦的步驟有較大出入。
建議：
CST 推薦封閉液用 5% 脫脂奶粉／TBST，室溫 1 h；
一抗稀釋液、稀釋比參考抗體說明書，推薦 4 ℃ 過夜孵育；
二抗用 5% 脫脂奶粉／TBST 稀釋，工作濃度切忌過高，室溫孵育 1 h；
要用 1XTBST 緩沖液充分洗滌。
