影響蛋白質(zhì)鹽析的因素有哪些?
(1)溫度:除對溫度敏感的蛋白質(zhì)在低溫(4度)操作外,一般可在室溫中進(jìn)行。一般溫度低蛋白質(zhì)溶介度降低。但有的蛋白質(zhì)(如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白)在較高的溫度(25度)比0度時溶解度低,更容易鹽析。
(2)pH值:大多數(shù)蛋白質(zhì)在等電點時在濃鹽溶液中的溶介度最低。
(3)蛋白質(zhì)濃度:蛋白質(zhì)濃度高時,欲分離的蛋白質(zhì)常常夾雜著其他蛋白質(zhì)地一起沉淀出來(共沉現(xiàn)象)。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋,使蛋白質(zhì)含量在2.5-3.0%。
蛋白質(zhì)鹽析常用的中性鹽,主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。 其中應(yīng)用最多的硫酸銨,它的優(yōu)點是溫度系數(shù)小而溶解度大(25度時飽和溶液為4.1M,即767克升;0度時飽和溶解度為3.9M,即676克/升),在這一溶解度范圍內(nèi),許多蛋白質(zhì)和酶都可以鹽析出來;另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好,不易引起蛋白質(zhì)變性。硫酸銨溶液的pH常在4.5-5.5之間,當(dāng)用其他pH值進(jìn)行鹽析時,需用硫酸或氨水調(diào)節(jié)。蛋白質(zhì)在用鹽析沉淀分離后,需要將蛋白質(zhì)中的鹽除去,常用的辦法是透析,即把蛋白質(zhì)溶液裝入秀析袋內(nèi)(常用的是玻璃紙),用緩沖液進(jìn)行透析,并不斷的更換緩沖液,因透析所需時間較長,所以最好在低溫中進(jìn)行。此外也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過柱的辦法除鹽,所用的時間就比較短。