新型冠狀病毒（2019-nCoV）核酸實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)要點(diǎn)
2020庚子之春，突如其來的新冠病毒疫情，又一次將PCR推在疫情防控的前沿，使核酸檢測(cè)成為熱搜。那么，什么是核酸檢測(cè)？它在新冠肺炎的診斷中起什么作用？如何發(fā)揮作用？如何在檢測(cè)中保護(hù)檢測(cè)人員安全、避免交叉?zhèn)魅竞投挝廴?？為了幫助更多人了解這個(gè)熟悉而陌生的名字，帶著諸多問題，讓我們從實(shí)驗(yàn)室角度走近2019-nCoV核酸檢測(cè)。
一、新冠病毒核酸檢測(cè)的原理??
2019新冠病毒是一種RNA病毒，即遺傳物質(zhì)是RNA（核糖核酸）。病毒由RNA和蛋白構(gòu)成，最外一層由脂質(zhì)和糖蛋白組成包膜外衣，里面蛋白衣殼將RNA包裹在其中，從而使容易降解RNA得到保護(hù)。病毒通過特定細(xì)胞表面的受體入侵細(xì)胞造成感染，并利用宿主細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制增殖。病毒核酸檢測(cè)的原理就是通過細(xì)胞裂解液，讓病毒的RNA裸露出來，然后用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)原理最關(guān)鍵的是利用引物和探針來實(shí)現(xiàn)核酸序列的“靶向匹配”，即尋找新冠病毒約3萬個(gè)堿基中區(qū)別于其他病毒的核酸序列（與其他病毒核酸相似度“低”的區(qū)域），設(shè)計(jì)引物和探針。因?yàn)橐锖吞结樑c新冠病毒核酸特定區(qū)域高度匹配，即特異性很強(qiáng)，一但待檢標(biāo)本PCR擴(kuò)增結(jié)果為陽性，則證明該標(biāo)本中存在新冠病毒。
圖1 新冠病毒結(jié)構(gòu)示意圖
?圖2 新冠病毒核酸測(cè)定（實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法）的步驟
二、核酸檢測(cè)對(duì)于新冠病毒感染診斷的意義？
依據(jù)《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第六版）》確診病例要求，臨床診斷病例或疑似病例，具備以下病原學(xué)證據(jù)之一者：1.呼吸道標(biāo)本或血液標(biāo)本實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)新型冠狀病毒核酸為陽性；2.呼吸道標(biāo)本或血液標(biāo)本病毒基因測(cè)序，與已知的新型冠狀病毒高度同源。因此，新冠病毒核酸檢測(cè)（RT-PCR方法）是確診感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”之一，這個(gè)“金標(biāo)準(zhǔn)”是指“陽性”結(jié)果而言，即擴(kuò)增陽性可以作為確診新冠肺炎的依據(jù)。但另一方面，如果檢測(cè)結(jié)果為“陰性”，不能作為判斷患者未被感染的標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)鐘南山院士發(fā)布的近1100例新冠肺炎患者臨床數(shù)據(jù)顯示，在入院接受CT檢查時(shí)，76.4%的患者呈現(xiàn)了肺炎表現(xiàn)，主要為毛玻璃樣陰影（50%）和雙肺斑片狀陰影（46.4%），絕大多數(shù)重癥患者都能以此確診。而根據(jù)此前專家表態(tài)“確診患者中，核酸檢測(cè)的陽性率約僅為30-50%”來看，新冠患者核酸檢測(cè)假陰性的比例并不低。因此核酸檢測(cè)不能作為確診感染的唯一手段，數(shù)據(jù)顯示如果把CT檢查、核酸試劑盒和臨床癥狀結(jié)合在一起，確診的準(zhǔn)確率可以達(dá)到97%。
三、臨床實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行新冠病毒核酸檢測(cè)的條件和要求？
核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室能夠進(jìn)行2019-nCoV核酸檢測(cè)需要符合（國家衛(wèi)生健康委辦公廳關(guān)于醫(yī)療機(jī)構(gòu)開展新型冠狀病毒核酸檢測(cè)有關(guān)要求的通知（國衛(wèi)辦醫(yī)函[2020]53號(hào)）的要求，達(dá)到二級(jí)以上實(shí)驗(yàn)室生物安全防護(hù)及三級(jí)個(gè)人生物安全防護(hù)規(guī)范并經(jīng)衛(wèi)生行政相關(guān)部門批準(zhǔn)，方可開展。PCR實(shí)驗(yàn)室負(fù)壓環(huán)境最為理想，注意壓力監(jiān)測(cè)，保持空氣流動(dòng)，排除氣溶膠。核酸檢測(cè)人員必須具備相應(yīng)資質(zhì)，接受2019-nCoV相關(guān)培訓(xùn)并考核合格。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格管理，有效門禁，分區(qū)到位，嚴(yán)格禁止無關(guān)人員進(jìn)入。清潔區(qū)保持通風(fēng)，消毒到位。相關(guān)物品分區(qū)放置，潔污分離，按時(shí)更換，洗消到位。常規(guī)消毒：較大面積以含氯消毒液為主，小面積可以用75%酒精。處理氣溶膠的良好方式是開窗通風(fēng)，也可以空氣消毒（如紫外、過濾、空氣消毒機(jī)方式）。
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圖3 核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室個(gè)人三級(jí)生物安全防護(hù)示意圖
四、新冠病毒核酸檢測(cè)與分析流程？
核酸檢測(cè)三大步驟的具體要求如下：
1.分析前----標(biāo)本采集：在最新版的新冠肺炎診療方案中（第六版），其確診所提到的樣本類型包含了呼吸道樣本、血液樣本、糞便樣本等。在標(biāo)本選擇上，首選為下呼吸道樣本（如深部痰液、灌洗液等），次選為上呼吸道樣本（如鼻咽拭子等），再次選為血液樣本、糞便樣本等。標(biāo)本采集由?？疲ㄈ纾汉粑啤l(fā)熱門診等）臨床醫(yī)生或護(hù)士在個(gè)人三級(jí)生物安全防護(hù)條件下進(jìn)行。標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)：標(biāo)本裝入密封袋，密封袋置于標(biāo)本盒，注意保持直立不倒，標(biāo)本盒封閉前消毒。標(biāo)本盒置于標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)箱，轉(zhuǎn)運(yùn)箱封閉前，須紫外或噴霧消毒。新冠標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)箱要有統(tǒng)一特殊標(biāo)識(shí)。建議醫(yī)療機(jī)構(gòu)內(nèi)部轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)，標(biāo)本采集之后立即運(yùn)抵實(shí)驗(yàn)室，不超過2h。新冠病毒標(biāo)本要單獨(dú)專人轉(zhuǎn)運(yùn)，不要和其他物品混雜。如標(biāo)本外送應(yīng)用專門的二級(jí)標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)容器運(yùn)送，且在個(gè)人二級(jí)生物安全防護(hù)條件下運(yùn)送。標(biāo)本接收：從密封袋取出標(biāo)本后，須紫外或75%酒精噴霧消毒。新冠標(biāo)本屬于高風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)本，建議采集、轉(zhuǎn)運(yùn)、接收環(huán)節(jié)有簽字，以便回溯。操作者須二級(jí)生物安全防護(hù)。
樣本采集環(huán)節(jié)中咽拭子取樣有哪些注意細(xì)節(jié)？新冠核酸檢測(cè)最常用的標(biāo)本為咽拭子，方法為用2根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子同時(shí)擦拭雙側(cè)咽扁桃體及咽后壁，將拭子頭浸入含3ml采樣液的管中，尾部棄去，旋緊管蓋。對(duì)于新冠病毒，核酸擴(kuò)增試驗(yàn)時(shí)的處理、抽提、擴(kuò)增為高風(fēng)險(xiǎn)，因此擴(kuò)增前需要對(duì)標(biāo)本先行滅活病毒，包括60～65℃孵育20～30min，或者用試劑盒自帶的采樣液滅活病毒。以核酸提取裂解液為基礎(chǔ)配制的病毒采樣液，主要成分為平衡鹽類、EDTA螯合劑、胍鹽(如異硫氰酸胍、鹽酸胍等)、陰離子表面活性劑(如十二烷基硫酸鈉)、陽離子表面活性劑(如十四烷基三甲基草酸銨)、苯酚、8-羥基喹啉、二硫蘇糖醇(DTT)、蛋白酶K等幾種或多種組分。這種病毒保存液一方面直接裂解病毒釋放核酸，消除核酸分解酶(RNase)以防止病毒的RNA降解。另外一方面，又要讓病毒的蛋白變性，失去活性而“死掉”，不再有傳染性，提高運(yùn)輸和檢測(cè)階段的安全性。
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圖4 咽拭子采樣流程圖
2.分析中----分析中實(shí)驗(yàn)操作需在實(shí)驗(yàn)室二級(jí)生物安全防護(hù)條件下進(jìn)行。標(biāo)本處理：標(biāo)本處理整個(gè)過程應(yīng)在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，生物安全柜內(nèi)應(yīng)配備吸水棉、消毒酒精，有條件時(shí)可配備吸水臺(tái)布，以防樣本外撒時(shí)應(yīng)急處理，打開樣本密封袋或二級(jí)容器，用75%酒精消毒外樣本表面，檢查樣本是否密閉性后，然后取出樣本袋，進(jìn)行標(biāo)本滅活處理后，再進(jìn)行標(biāo)本離心，標(biāo)本離心時(shí)，開啟通風(fēng)設(shè)施，操作者盡可能在生物安全柜中將離心管放入和取出轉(zhuǎn)子。標(biāo)本離心無意外，離心停止10
min以上，開離心機(jī)蓋噴霧消毒。標(biāo)本檢測(cè)：新冠病毒核酸檢測(cè)需要二名工作人員進(jìn)行核酸提取或加樣操作。新冠病毒標(biāo)本核酸擴(kuò)增試驗(yàn)時(shí)的處理、抽提、擴(kuò)增均為是高風(fēng)險(xiǎn)過程，個(gè)人須三級(jí)生物安全防護(hù)、全排式生物安全柜內(nèi)操作。
新冠病毒核酸測(cè)定（實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法）的關(guān)鍵參數(shù)？自國家藥品監(jiān)督管理局啟動(dòng)《醫(yī)療器械應(yīng)急審批程序》以來，諸多核酸檢測(cè)試劑盒“蜂擁而出”。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，國內(nèi)目前有近百家企業(yè)表示已成功研發(fā)新冠病毒檢測(cè)試劑盒，可供臨床新冠病毒核酸檢測(cè)。截至2020年3月6日，國家藥品監(jiān)督管理局共批準(zhǔn)新冠病毒核酸檢測(cè)試劑共10個(gè)，其中熒光PCR法8個(gè)（詳見國家藥品監(jiān)督管理局官網(wǎng)）。目前批準(zhǔn)產(chǎn)品均基于新冠病毒基因組中開放讀碼框1a/b（open
reading frame 1ab，ORF1ab）、包膜蛋白（Envelope protein，E）和核衣殼蛋白（nucleocapsid
protein，N）進(jìn)行選擇。不同產(chǎn)品的檢測(cè)原理基本一致，但是其引物、探針設(shè)計(jì)存在不同，有單靶區(qū)段（ORF1ab）、雙靶區(qū)段（ORF1ab、N或E）、三靶區(qū)段（ORF1ab、N和E）的檢測(cè)和判讀差別，建議使用者應(yīng)嚴(yán)格按照不同企業(yè)說明書規(guī)定的判讀方式進(jìn)行判讀。目前，根據(jù)《新型冠狀病毒感染的肺炎實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南（第四版）》推薦選用針對(duì)新型冠狀病毒的ORF1ab和N基因區(qū)域的引物和探針，并給出了引物序列。
靶標(biāo)一（ORF1ab基因）：
正向引物（F）：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA
反向引物（R）：ACGATTGTGCATCAGCTGA
熒光探針（P）：5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'
靶標(biāo)二（N基因）：
正向引物（F）：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT
反向引物（R）：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG
熒光探針（P）：5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'
核酸提取和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)體系參考相關(guān)廠家試劑盒說明。
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圖5 新冠病毒擴(kuò)增子靶標(biāo)在基因組上的定位
3.分析后----報(bào)告發(fā)放：檢驗(yàn)報(bào)告建議有特殊標(biāo)識(shí)，建議無紙化辦公。發(fā)回隔離區(qū)的檢驗(yàn)報(bào)告單，除非經(jīng)過有效消毒，不宜出隔離區(qū)。檢測(cè)后的消毒處理：檢測(cè)完成后，工作人員應(yīng)立即用75%酒精消毒處理外層手套，脫掉外層手套，放置生物安全柜內(nèi)的垃圾桶中。檢測(cè)完成后生物安全柜用0.5-1%有效氯消毒劑或75%酒精擦拭工作臺(tái)面及地面。將安全柜內(nèi)產(chǎn)生的醫(yī)療垃圾裝入三層垃圾袋密封內(nèi)，放入指定的垃圾桶中，垃圾袋上需標(biāo)記醫(yī)療垃圾信息。生物安全柜和整個(gè)實(shí)驗(yàn)室空間均需紫外線消毒，至少30min。工作人員由他人協(xié)助用75%酒精對(duì)一次性外隔離衣進(jìn)行消毒處理，脫去隔離衣并放入新冠檢測(cè)醫(yī)用垃圾指定的垃圾桶中。工作人員在離開二級(jí)實(shí)驗(yàn)室后，應(yīng)在緩沖區(qū)脫去脫去二級(jí)防護(hù)用品，首先戴新手套，摘護(hù)目鏡并放入75%酒精中浸泡消毒；脫一次性防護(hù)服，自上而下，由內(nèi)向外，反轉(zhuǎn)脫一次性防護(hù)服，脫一次性手套，摘N95一次性口罩，摘一次性帽子，脫一次性鞋套，脫手套。所有實(shí)驗(yàn)室垃圾均需高壓滅菌處理后，按普通醫(yī)用垃圾處理。
五、新冠病毒核酸測(cè)定（qRT-PCR法）如何進(jìn)行結(jié)果判讀？
依據(jù)《新型冠狀病毒感染的肺炎實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南（第四版）》提供的引物及擴(kuò)增參數(shù)，基因擴(kuò)增結(jié)果判斷如下。陰性：無Ct值或Ct≥40。陽性：Ct值<37，可報(bào)告為陽性?；叶葏^(qū)：Ct值在37-40之間，建議重復(fù)實(shí)驗(yàn)，若重做結(jié)果Ct值<40，擴(kuò)增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性,否則為陰性。依據(jù)《新型冠狀病毒感染的肺炎實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南（第五版）》在實(shí)驗(yàn)室要確認(rèn)一個(gè)病例為新冠病毒核酸檢測(cè)陽性，滿足以下兩個(gè)條件中的一個(gè)：
1．同一份標(biāo)本中新型冠狀病毒2個(gè)靶標(biāo)（ORF1ab、N）實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)結(jié)果均為陽性。如果出現(xiàn)單個(gè)靶標(biāo)陽性的檢測(cè)結(jié)果則需要重新采樣重新檢測(cè)。如果仍然為單靶標(biāo)陽性判定為陽性。
2．兩種標(biāo)本實(shí)時(shí)熒光RT-PCR同時(shí)出現(xiàn)單靶標(biāo)陽性或同種類型標(biāo)本兩次采樣檢測(cè)中均出現(xiàn)單個(gè)靶標(biāo)陽性的檢測(cè)結(jié)果可判定為陽性。
但是，不同生產(chǎn)企業(yè)的產(chǎn)品依據(jù)自身產(chǎn)品的性能選定的基因不同，確定的Ct陽性界值也不同，如果用的是商品化試劑盒，則以廠家提供的說明書為準(zhǔn)。此外，陰性結(jié)果也不能排除新冠病毒感染，需要排除可能產(chǎn)生假陰性的因素，包括：樣本質(zhì)量差，比如口咽等部位的呼吸道樣本；樣本收集的過早或過晚；沒有正確的保存、運(yùn)輸和處理樣本；技術(shù)本身存在的原因，如病毒變異、PCR抑制等。
六、新冠核酸檢測(cè)出現(xiàn)假陰性的原因？
目前大家所關(guān)注的核酸檢測(cè)“假陰性”概念，往往是指核酸檢測(cè)結(jié)果與臨床表現(xiàn)不符的“假陰性”，即臨床癥狀及影像學(xué)高度疑似新冠肺炎，但核酸檢測(cè)多次或始終為“陰性”。根據(jù)國家衛(wèi)健委臨床檢驗(yàn)中心給出的新冠病毒檢測(cè)“假陰性”的解釋如下。在被感染者中檢出核酸，需同時(shí)滿足以下四個(gè)條件，
1.被感染者的細(xì)胞中有一定量的病毒：現(xiàn)有數(shù)據(jù)顯示機(jī)體被病毒感染后，病毒通過鼻腔和口腔進(jìn)入到咽喉部，再到氣管和支氣管，進(jìn)而到達(dá)肺泡，感染者會(huì)經(jīng)歷潛伏期、輕度癥狀、再到嚴(yán)重癥狀的過程，不同病程階段以及機(jī)體不同部位存在的病毒量有所不同。從細(xì)胞種類的病毒載量看，肺泡上皮細(xì)胞（下呼吸道）＞氣道上皮細(xì)胞（上呼吸道）＞成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等；從標(biāo)本類型來看，肺泡灌洗液（最優(yōu)）＞深咳痰＞鼻咽拭子＞口咽拭子＞血液。此外，糞便也有報(bào)道能檢出病毒。但是考慮操作的方便性和患者的接受程度，目前臨床常用的標(biāo)本順序是口咽部拭子＞鼻咽部拭子＞支氣管灌洗液（操作復(fù)雜）和深痰（常為干咳難得到）。因此在某些患者中，口咽部或鼻咽部細(xì)胞中病毒量較少或極低，如果只取口咽部或鼻咽部標(biāo)本檢測(cè)，病毒核酸就檢測(cè)不到。
2.標(biāo)本采集時(shí)要采集到含有病毒的細(xì)胞并有效保存病毒核酸：①采集部位不當(dāng)，如采集口咽拭子時(shí)，采集深度不夠；采集鼻咽拭子沒有采到鼻腔深處等，可能采集到的細(xì)胞絕大部分都是不含病毒的細(xì)胞。②采樣拭子使用錯(cuò)誤，例如拭子頭的材料推薦使用PE纖維、聚酯纖維、聚丙烯纖維等合成纖維，實(shí)際操作中使用了棉花等天然纖維（對(duì)蛋白質(zhì)的吸附較強(qiáng)，不易洗脫）和尼龍類的纖維（吸水性不佳，導(dǎo)至采樣量不足）。③病毒保存管使用錯(cuò)誤，例如誤用了易吸附核酸（DNA/RNA）的聚丙烯或聚乙烯塑料的保存管，導(dǎo)至保存液中核酸濃度下降。實(shí)際操作中推薦使用聚乙烯-丙烯聚合物塑膠與某些特殊處理的聚丙烯塑膠容器儲(chǔ)存病毒核酸。上述環(huán)節(jié)操作不當(dāng)均可能造成“假陰性”。
3.可靠的體外診斷試劑：部分廠家的試劑產(chǎn)品由于研發(fā)時(shí)間短，也沒有使用已知臨床樣本進(jìn)行必要的性能確認(rèn)，可能存在對(duì)試劑優(yōu)化不充分以及試劑批間差異大等問題。
4.規(guī)范的臨床實(shí)驗(yàn)室：標(biāo)本運(yùn)輸保存條件、臨床實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范操作、結(jié)果判讀和質(zhì)量控制等也是保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的關(guān)鍵因素。
七、如何才能將新冠核酸檢測(cè)“假陰性”的可能降到最低？
降低核酸檢測(cè)假陰性應(yīng)相對(duì)應(yīng)地從產(chǎn)生假陰性的四個(gè)方面進(jìn)行優(yōu)化：
1.被感染者的細(xì)胞中有一定量的病毒：一個(gè)特定的疑似感染的患者，不同的病期，在不同的身體部位出現(xiàn)病毒的濃度會(huì)有差異，如咽部沒有，卻可能支氣管灌洗液或糞便中有，如能同時(shí)或在疾病過程中的不同時(shí)間采取上述多種標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，會(huì)有助于“假陰性”的避免。
2.標(biāo)本采集時(shí)要采集到含有病毒的細(xì)胞：通過加強(qiáng)對(duì)標(biāo)本采集人員的培訓(xùn)，可以在很大程度上解決該問題。
3.可靠的體外診斷試劑：通過從國家層面開展試劑的檢測(cè)性能評(píng)價(jià)研究，探討存在的問題，可以進(jìn)一步改進(jìn)試劑質(zhì)量，提高分析敏感性。
4.規(guī)范的臨床實(shí)驗(yàn)室：通過加強(qiáng)對(duì)實(shí)驗(yàn)室人員的培訓(xùn)，不斷完善實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系，保證合理的分區(qū)、有能力的檢測(cè)人員和嚴(yán)格的質(zhì)量管理體系，可以減少因?qū)嶒?yàn)室檢測(cè)操作層面出現(xiàn)的“假陰性”。
八、為什么康復(fù)出院患者中再次出現(xiàn)新冠病毒核酸檢測(cè)“陽性”？
新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第六版）》中明確規(guī)定，在新冠肺炎治愈出院的標(biāo)準(zhǔn)之一就是連續(xù)兩次檢測(cè)病毒核酸，若兩次檢測(cè)結(jié)果均為陰性，才具備出院指針，但近來有極少數(shù)出院患者中為什么再次出現(xiàn)新冠病毒核酸檢測(cè)陽性？會(huì)不會(huì)再次感染？其原因是多樣的。
1.新冠病毒是一個(gè)新病毒，它的致病機(jī)理、疾病全貌和病程特點(diǎn)還需要進(jìn)一步加深認(rèn)識(shí)，所以我們一方面要進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)出院患者的管理，要進(jìn)行14天的醫(yī)學(xué)觀察，同時(shí)觀察當(dāng)中應(yīng)加強(qiáng)跟蹤隨訪、健康監(jiān)測(cè)和健康指導(dǎo)，同時(shí)對(duì)疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸的全程進(jìn)一步加深認(rèn)識(shí)。
2.就病毒而言，患者有再次感染的可能。鐘南山院士說：由于治愈的患者體內(nèi)有抗體，因此新冠病毒再次入侵時(shí)可被抗體消滅，再次感染的幾率不大，但“不大”并不代表“不會(huì)感染”，再次感染有多方面的原因，可能為康復(fù)患者自身的原因，也可能與病毒的改變有關(guān)，也可能為實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的原因。如果是病毒自身的原因，新冠病毒變異可能導(dǎo)至康復(fù)患者自身產(chǎn)生的抗體對(duì)變異病毒無效，若患者再次被感染變異病毒，則核酸檢測(cè)可能再次陽性。
3.就實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法而言，每一種檢測(cè)方法都有其極限性。病毒核酸檢測(cè)因因基因序列的選擇，試劑的組成，方法的敏感程度等原因，導(dǎo)至現(xiàn)有的試劑盒均存在檢測(cè)下限。當(dāng)患者經(jīng)過治療后，體內(nèi)病毒減少，待檢樣本中病毒載量低于檢測(cè)下限時(shí)即會(huì)出現(xiàn)“陰性”結(jié)果，但此結(jié)果并不意味著體內(nèi)病毒完全消失，病毒有可能在停止治療后“死灰復(fù)燃”。因此，建議出院后2-4周各復(fù)查一次，以防漏網(wǎng)之魚。
4.就核酸而言，核酸為病毒的遺傳物質(zhì)，患者經(jīng)過抗病毒治療病毒被殺滅，但殘骸的病毒遺傳物質(zhì)RNA（核酸）片段仍然在人體內(nèi)存留，并沒有完全從體內(nèi)排出體外，有時(shí)在特定的環(huán)境下，可以存留較長的時(shí)間，而在這時(shí)做核酸檢測(cè)會(huì)出現(xiàn)“一過性”陽性。隨著患者恢復(fù)時(shí)間進(jìn)展，在體內(nèi)殘留的RNA片段逐漸排盡后，核酸可轉(zhuǎn)為陰性結(jié)果。
5.就臨床意義而言，新冠病毒的核酸檢測(cè)，只是證明病毒RNA的存在與否，不能證明病毒活性以及病毒是否具有傳播性。要證明核酸檢測(cè)再次陽性的患者是否會(huì)再次成為傳染源，要靠其臨床標(biāo)本進(jìn)行病毒培養(yǎng)，培養(yǎng)出“活的”病毒存在才能證明其具有傳染性。
綜上所述，新冠病毒核酸檢測(cè)與臨床表現(xiàn)不符，如“假陰性”“康復(fù)后陽性”的情況無法完全避免，在實(shí)際篩查和檢測(cè)中，建議應(yīng)聯(lián)合臨床癥狀、影像學(xué)檢查（CT）及實(shí)驗(yàn)室檢查（核酸檢查+病毒特異性抗體檢測(cè)）進(jìn)行綜合診斷，以防漏診誤診。如臨床人員對(duì)檢測(cè)結(jié)果感覺明顯不符，建議對(duì)整個(gè)檢測(cè)環(huán)節(jié)（如樣本的采集、流轉(zhuǎn)及處理等環(huán)節(jié)）進(jìn)行綜合分析，不排除新型冠狀病毒早期感染、復(fù)發(fā)感染或合并其他呼吸道病毒感染等。如條件允許，建議采集痰液或肺泡灌洗液等敏感性更高的樣本進(jìn)行復(fù)測(cè)。
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