聚乙二醇沉淀法純化質(zhì)粒DNA實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)方法原理 這種方法最早由 Richaed Treisman ( 英國(guó)，倫敦，ICRF) 參照 Lis 的工作而設(shè)計(jì)。Lis 是最早用聚乙二醇（PEG ) 分離不同大小 DNA 的人。Treisman 法被廣泛用于堿裂解法制備的質(zhì)粒 DNA 的純化。
實(shí)驗(yàn)材料 粗制質(zhì)粒
試劑、試劑盒 氯仿乙醇異丙醇LiClPEG-MgCI2 酚氯仿乙酸鈉TE
儀器、耗材 Sorvall SS-34 或與其相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)頭冰水浴
實(shí)驗(yàn)步驟
一、材料
1. 緩沖液和溶液
(1) 氯仿
(2) 乙醇
(3) 異丙醇
(4) LiCl ( 5 mol/L)
(5) PEG-MgCI2 溶液
(6) 酚：氯仿（1:1，V/V）
(7) 乙酸鈉（3 mol/L, pH 5.2 )
(8) TE ( pH 8.0 )
(9) TE ( pH 8.0）含 20 μg/ml RNase A
2. 核酸和寡核苷酸
粗制質(zhì)粒
3. 離心機(jī)和轉(zhuǎn)頭
Sorvall SS-34 或與其相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)頭
4. 專用設(shè)備
冰水浴
二、方法
1. 將 3 ml 粗制質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到 15 ml Corex 管中，在冰浴中冷卻至 0℃。
2. 加入 3 ml 冰預(yù)冷的 5 mol/L LiCl，混勻，于 4℃ 離心 12000 g ( Sorvall SS-34 轉(zhuǎn)頭，10000 r/min ) 10 min。
3. 轉(zhuǎn)移上清至 30 ml Corex 管中，加等體積異丙醇，混勻，室溫離心回收核酸，12000 g ( Sorvall SS-34 轉(zhuǎn)頭，10000 r/min ) 10 min。
4. 小心倒去上清，倒置管口，使液體流干。室溫下用 70% 乙醇洗沉淀和管壁。小心將乙醇倒去，用真空抽吸器將管壁上殘留的乙醇抽干。在紙巾上倒置數(shù)分鐘，使無(wú)可見(jiàn)乙醇?xì)埩?。但?yīng)使沉淀保持濕潤(rùn)。
5. 用 500 μl 含 RNase A 的 TE ( pH8.0 ) 溶解濕潤(rùn)的核酸沉淀。將溶液轉(zhuǎn)移到微量離心管，室溫放置 30 min。
6. 將質(zhì)粒-RNase 混合物用酚：氯仿抽提一次，然后用氯仿抽提一次。
7. 用標(biāo)準(zhǔn)的乙醇沉淀法回收 DNA。
8. 將質(zhì)粒 DNA 沉淀用 1 ml 滅菌水溶解，再加入 0.5 ml PEG-MgCl2 溶液。
9. 室溫放置超過(guò) 10 min，然后于室溫用微量離心機(jī)在最大速度離心 20 min, 以回收沉淀的質(zhì)粒 DNA。
10. 沉淀用 0.5 ml 70% 乙醇重懸以去除微量 PEG, 用微量離心機(jī)在最大速度離心 5 min 以回收核酸。
11. 吸去乙醇，重復(fù)步驟10。第二次洗滌后，在離心管架上放置 10~20 min, 使乙醇揮發(fā)。
12. 濕潤(rùn)的質(zhì)粒沉淀用 500 μl TE ( pH 8.0 ) 溶解。以 1:100 用 TE ( pH8.0）稀釋后測(cè) OD260 并計(jì)算質(zhì)粒 DNA 的濃度。按 1OD260 =50μg 質(zhì)粒 DNA/ml 計(jì)算。
13. 分裝 DNA 并保存于 -20℃。
