搞定恒溫擴增分子診斷（RPA/RAA）
分子診斷技術今日不同以往，著實借力突飛猛進，恒溫擴增技術由于其擴增期間不需要特殊的儀器設備而更受矚目。恒溫擴增方法有多種，今天就回顧RPA/RAA，讓大家一文通俗搞定！
為了確保大家所認知的基本概念是一致的，請先了解以下名詞解釋
重組酶聚合酶擴增技術，RPA, recombinase polymerase amplification
重組酶介導的擴增技術，RAA, recombinase-aidamplification
重組酶，recombinase，同引物形成蛋白-核酸復合物，指導引物與模板結合，起到定位作用；幫助DNA 模板的解鏈和促使模板與引物之間發(fā)生鏈替換。
單鏈DNA結合蛋白，SSB, single stranded DNA binding。同置換出來的單鏈DNA結合，防止DAN配對兩條鏈再次結合。
DNA聚合酶，DNA polymerase，以DNA為模板，利用dNTP合成子代DNA。
核酸內切酶，endonuclease，可水解分子鏈內部磷酸二酯鍵生成寡核苷酸。
Nfo，來源于細菌的核酸內切酶，且更傾向于作用于3′凹末端的雙鏈DNA，參與DNA損傷修復。
RPA和RAA的工作原理
相同點：
3種關鍵酶或蛋白：重組酶、單鏈結合蛋白和DNA聚合酶； 在37℃恒溫下進行核酸快速擴增；
?唯一不同點：酶的來源不同，推測主要時因為ZL限制問題。
RPA的重組酶來源于T4噬菌體； RAA的重組酶來源于細菌或者真菌。
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下面以RPA操作原理為主進行系統(tǒng)的應用介紹
RPA工作原理要點：
1、在ATP存在條件下，重組酶與引物結合, 形成蛋白-核酸聚合體，并搜索配對目標；
2、當引物尋找到配對DNA模板，ATP水解供應能量，重組酶離開引物，并在DNA聚合酶的作用下合成新DNA鏈；
3、同時，單鏈DNA結合蛋白(singlestrandedDNA binding, SSB)同被置換出來的DNA單鏈進行結合，防止DNA模板再次形成雙鏈。
RPA原理圖
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基于RPA方法的探針檢測法
工作原理要點：
基于RPA開發(fā)的探針法
介于RPA方法膠體金層析檢測法
工作原理要點：
基于RPA開發(fā)的膠體金層析法
?小結
RPA/RAA整個反應非常速度，約30min就可以得到結果；
靈敏度可達10copies/ul；
擴增引物長度30-35bp，太短引物會影響特異性、靈敏度和擴增速度；
且擴增期間不需要復雜的儀器；
在此基礎上開發(fā)的探針法或膠體金層析法都大大簡化了檢測結果的使用儀器，可以更好的滿足不具備分子檢測條件的基層或者經(jīng)濟較為落后的地區(qū)。
