分子診斷常用技術(shù)（一）
分子診斷技術(shù)即是利用分子生物學(xué)方法對人類及病原體的各類遺傳物質(zhì)進行檢測，以幫助對疾病進行診斷。以技術(shù)原理出發(fā)對分子診斷技術(shù)進行歸類與評價，以對目前臨床常用技術(shù)的沿革進行回顧。
1961 年Hall 建立的液相分子雜交法標(biāo)志著人類掌握分子生物學(xué)技術(shù)對特定核酸序列進行檢測，開啟了對疾病分子診斷的大門。1983 年Mullis提出的聚合酶鏈反應(yīng)( PCR) 概念，更是給分子診斷技術(shù)插上了基因擴增的翅膀，大大提高了基因檢測技術(shù)的敏感度與特異性，降低了分子診斷的技術(shù)門檻。按照檢測的原理對半個世紀中臨床常用的分子診斷方法進行歸類，以分子雜交、核酸序列測定、分子構(gòu)象變異與定量PCR 4大類對其歷史沿革、技術(shù)原理與實踐應(yīng)用進行簡要的介紹與評論，以更好的回顧過去，展望分子診斷領(lǐng)域的未來。
一、基于分子雜交的分子診斷技術(shù)
上世紀60 年代至80 年代是分子雜交技術(shù)發(fā)展最為迅猛的20 年，由于當(dāng)時尚無法對樣本中靶基因進行人為擴增，人們只能通過已知基因序列的探針對靶序列進行捕獲檢測。其中液相和固相雜交基礎(chǔ)理論、探針固定包被技術(shù)與cDNA 探針人工合成的出現(xiàn)，為基于分子雜交的體外診斷方法進行了最初的技術(shù)儲備。
( 一) DNA 印跡技術(shù)( Southernblot)
Southern于1975 年發(fā)明了DNA 印跡技術(shù)，通過限制性內(nèi)切酶將DNA 片段化，再以凝膠電泳將長度不等的DNA 片段進行分離，通過虹吸或電壓轉(zhuǎn)印至醋酸纖維膜上，再使膜上的DNA 變性與核素標(biāo)記的寡核苷酸探針進行分子雜交，經(jīng)洗脫后以放射自顯影鑒別待測的DNA 片段-探針間的同源序列。這一方法由于同時具備DNA 片段酶切與分子探針雜交，保證了檢測的特異性。因此，一經(jīng)推出后便成為探針雜交領(lǐng)域最為經(jīng)典的分子檢測方法，廣為運用于各種基因突變，如缺失、插入、易位等，及與限制性酶切片段長度多態(tài)性( restriction fragmentlength polymorphism，RFLP) 的鑒定中。Alwine 等于1977 年推出基于轉(zhuǎn)印雜交的Northern blot 技術(shù)也同樣成為當(dāng)時檢測RNA的金標(biāo)準(zhǔn)。
( 二) ASO 反向斑點雜交(allele-specific oligonucleotide reverse dot blot，ASO-RDB)
使用核酸印跡技術(shù)進行核酸序列的雜交檢測具有極高的特異性，但存在操作極為繁瑣，檢測時間長的缺點。1980 年建立的樣本斑點點樣固定技術(shù)則擺脫了傳統(tǒng)DNA 印跡需要通過凝膠分離技術(shù)進行樣本固定的缺點。通過在質(zhì)粒載體導(dǎo)入單堿基突變的方法，構(gòu)建了首條等位基因特異性寡核苷酸探針( allele-specificoligonucleotide，ASO) ，更使對核酸序列點突變的檢測成為可能。1986 年，Saiki首次將PCR 的高靈敏度與ASO斑點雜交的高特異性結(jié)合起來，實現(xiàn)了利用ASO探針對特定基因多態(tài)性進行分型。其后為了完成對同一樣本的多個分子標(biāo)記進行高通量檢測，Saiki又發(fā)明了ASO-RDB，通過將生物素標(biāo)記的特異性PCR 擴增產(chǎn)物與固定于膜上的探針雜交顯色，進行基因分型、基因突變的檢測。該法可將多種寡核苷酸探針固定于同一膜條上，只需通過1 次雜交反應(yīng)，即可篩查待檢樣本DNA 的數(shù)十乃至數(shù)百種等位基因，具有操作簡單、快速的特點，一度成為基因突變檢測、基因分型與病原體篩選最為常用的技術(shù)。
( 三) 熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，FISH)
FISH 源于以核素標(biāo)記的原位雜交技術(shù)， 1977年Rudkin首次使用熒光素標(biāo)記探針完成了原位雜交的嘗試。在上世紀80 ～ 90 年代，細胞遺傳學(xué)和非同位素標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展將FISH 推向臨床診斷的實踐應(yīng)用。相比于其它僅針對核酸序列進行檢測的分子診斷技術(shù)，F(xiàn)ISH 結(jié)合了探針的高度特異性與組織學(xué)定位的優(yōu)勢，可檢測定位完整細胞或經(jīng)分離的染色體中特定的正?；虍惓NA序列; 由于使用高能量熒光素標(biāo)記的DNA 探針，可實現(xiàn)多種熒光素標(biāo)記同時檢測數(shù)個靶點。如今，F(xiàn)ISH 已在染色體核型分析，基因擴增、基因重排、病原微生物鑒定等多方面中得到廣泛應(yīng)用。通過比較基因組雜交( comparative genomic hybridization，CGH) 與光譜核型分析( spectral karyotyping，SKY) 等FISH 衍生技術(shù)，使其正在越來越多的臨床診斷領(lǐng)域中發(fā)揮作用。
(四) 多重連接探針擴增技術(shù)(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)
MLPA 技術(shù)于2002 年由Schouten 等首先報道。每個MLPA 探針包括2 個熒光標(biāo)記的寡核苷酸片段，1個由化學(xué)合成，1個由M13 噬菌體衍生法制備; 每個探針都包括1 段引物序列和1 段特異性序列。在MLPA 反應(yīng)中，2 個寡核苷酸片段都與靶序列進行雜交，再使用連接酶連接2 部分探針。連接反應(yīng)高度特異，只有當(dāng)2 個探針與靶序列完全雜交，連接酶才能將2 段探針連接成1 條完整的核酸單鏈; 反之，如果靶序列與探針序列不完全互補，即使只有1 個堿基的差別，就會導(dǎo)至雜交不完全，使連接反應(yīng)無法進行。連接反應(yīng)完成后，用1 對熒光標(biāo)記的通用引物擴增連接好的探針，每個探針擴增產(chǎn)物的長度都是唯一的。最后，通過毛細管電泳分離擴增產(chǎn)物，便可對把核酸序列進行檢測。由于巧妙地借鑒了擴增探針的原理，MLPA 技術(shù)最多可在1 次反應(yīng)中對45 個靶序列的拷貝數(shù)進行鑒定。
該技術(shù)具備探針連接反應(yīng)的特異性與多重擴增探針雜交的高通量特性。經(jīng)過MRC-Holland 公司10 余年的發(fā)展，MLPA 技術(shù)已成為涵蓋各種遺傳性疾病診斷、藥物基因?qū)W多遺傳位點鑒定、腫瘤相關(guān)基因突變譜篩查、DNA 甲基化程度定量等綜合分子診斷體系，是目前臨床最為常用的高通量對已知序列變異、基因拷貝數(shù)變異進行檢測的方法。
