分子和原子一樣，也有它的特征分子能級(jí)，分子內(nèi)部的運(yùn)動(dòng)可分為價(jià)電子運(yùn)動(dòng)、分子內(nèi)原子在平衡位置附近的振動(dòng)和分子繞其重心的轉(zhuǎn)動(dòng)。因此分子具有電子能級(jí)、振動(dòng)能級(jí)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)。
分子從外界吸收能量后，就能引起分子能級(jí)的躍遷，即從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，分子吸收能量同樣具有量子化的特征，即分子只能吸收等于二個(gè)能級(jí)之差的能量，符合：⊿E＝E2－E1＝hν=hc/λ
由于三種能級(jí)躍遷所需能量不同，所以需要不同波長的電磁輻射使它們躍遷，即在不同的光學(xué)區(qū)域出現(xiàn)吸收或發(fā)射譜帶。
某些物質(zhì)的分子吸收一定能量后，電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，以光輻射的形式從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)，這種現(xiàn)象稱為分子發(fā)光，在此基礎(chǔ)上建立起來的分析方法為分子發(fā)光分析法。
根據(jù)分子受激時(shí)所吸收能源及輻射光的機(jī)理不同分為：
光致發(fā)光：以光來激發(fā)而發(fā)光有分子熒光分析法和分總磷光分析法。
電致發(fā)光：以電能來激發(fā)而發(fā)光
生物發(fā)光：以生物體釋放的能量激發(fā)而發(fā)光
化學(xué)發(fā)光：以化學(xué)反應(yīng)能激發(fā)而發(fā)光—化學(xué)發(fā)光分析法
分子發(fā)光光譜原理
分子在一定的能量輻射下，也會(huì)從低能級(jí)躍遷到高能級(jí)，當(dāng)激發(fā)態(tài)分子以輻射躍遷形式釋放能量，然后返回到較低能級(jí)或基態(tài)時(shí)，便產(chǎn)生分子發(fā)光，依據(jù)激發(fā)的模式不同，分子發(fā)光包括光致發(fā)光（熒光或磷光）、熱至發(fā)光、場致發(fā)光和化學(xué)發(fā)光等。
處于激發(fā)態(tài)的電子，通常以輻射躍遷方式（熒光和磷光）或無輻射躍遷方式再回到較低能級(jí)的激發(fā)態(tài)或基態(tài)。無輻射躍遷：則是指以熱的形式輻射其多余的能量。
各種躍遷方式發(fā)生的可能性及程度，與熒光物質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)及激發(fā)時(shí)的物理和化學(xué)環(huán)境等因素有關(guān)。
分子熒光發(fā)射
處于第一激發(fā)單重態(tài)中的電子以輻射躍遷返回至基態(tài)各振動(dòng)能級(jí)時(shí)，就產(chǎn)生了分子熒光。
由于激發(fā)態(tài)中存在有振動(dòng)馳豫和內(nèi)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，使得熒光的光子能量比其受激發(fā)所吸收的光子能量低，因此熒光波長λ3較激發(fā)波長λ1或λ2都長。
注意：
不論電子開始被激發(fā)至什么高能級(jí)，最終將只發(fā)射出波長為λ3的熒光。熒光的產(chǎn)生在10-7-10-9s內(nèi)完成。
分子磷光發(fā)射
電子由基態(tài)單重態(tài)激發(fā)至第一激發(fā)三重態(tài)的幾率很小，因?yàn)檫@是禁阻躍遷。但是，由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，有可能以系間竄躍方式轉(zhuǎn)至第一激發(fā)三重態(tài)，再經(jīng)過振動(dòng)馳豫，轉(zhuǎn)至其最低振動(dòng)能級(jí)，由此激發(fā)態(tài)躍回至基態(tài)時(shí)，便發(fā)射磷光，這個(gè)躍遷過程（T1→S0）也是自旋禁阻的，其發(fā)光速率較慢，約為10-4-10s。因此，這種躍遷所發(fā)射的光，在光照停止后，仍可持續(xù)一段時(shí)間。
熒光與磷光的比較
1.熒光是由激發(fā)單重態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)至基態(tài)各振動(dòng)能級(jí)間躍遷產(chǎn)生；
磷光是由激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)至基態(tài)各振動(dòng)能級(jí)間躍遷產(chǎn)生的。
2.激發(fā)單重態(tài)的平均壽命大約為10-8s，熒光產(chǎn)生快，而激發(fā)三重態(tài)的平均壽命為10-3-10s，磷光產(chǎn)生稍慢。磷光壽命比熒光廠。
3.磷光輻射的波長比熒光長。
4.無論電子開始被激發(fā)至什么高能級(jí)，熒光和磷光的波長都是固定的。
激發(fā)光譜曲線和熒光、磷光光譜曲線
熒光和磷光均為光致發(fā)光，因此必須選擇合適的激發(fā)光波長，可根據(jù)它們的激發(fā)光譜曲線來確定。
繪制激發(fā)光譜曲線時(shí)，固定測量波長為熒光（或磷光）最大發(fā)射波長，然后改變激發(fā)波長，根據(jù)所測得的熒光（磷光）強(qiáng)度與激發(fā)光波長的關(guān)系，即可繪制激發(fā)光譜曲線。
注意：
激發(fā)光譜曲線與其吸收曲線可能相同，但激發(fā)光譜曲線是熒光強(qiáng)度與波長的關(guān)系曲線，
吸收曲線則是吸光度與波長的關(guān)系曲線，兩者在性質(zhì)上是不同的。當(dāng)然，在激發(fā)光譜曲線的最大波長處，處于激發(fā)態(tài)的分子數(shù)目是最多的，這可說明所吸收的光能量也是最多的，自然能產(chǎn)生最強(qiáng)的熒光。
繪制熒光或磷光光譜曲線：固定激發(fā)光波長為其最大激發(fā)波長，然后測定不同的波長時(shí)所發(fā)射的熒光或磷光強(qiáng)度即可。
在熒光和磷光的產(chǎn)生過程中，由于存在各種形式的無輻射躍遷，損失能量，所以它們的最大發(fā)射波長都向長波方向移動(dòng)，以磷光波長的移動(dòng)最多，而且它的強(qiáng)度也相對(duì)較弱。
熒光和分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系
分子產(chǎn)生熒光必須具備兩個(gè)條件：
① 分子必須具有與所照射的輻射頻率相適應(yīng)的結(jié)構(gòu)，才能吸收激發(fā)光；
②吸收了與其本身特征頻率相同的能量之后，必須具有一定的熒光量子產(chǎn)率。
熒光發(fā)射光譜的普遍特性
1.Stokes位移
分子的熒光光譜的波長總是比激發(fā)光譜的波長要長，這種波長位移的現(xiàn)象稱為Stokes位移。
2.熒光發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)
3.鏡像規(guī)則，通常熒光發(fā)射光譜和它的吸收光譜呈鏡像對(duì)稱關(guān)系。
溶液熒光猝滅
熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子的相互作用引起熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象稱為熒光猝滅。能引起熒光強(qiáng)度降低的物質(zhì)稱為猝滅劑。
1.碰撞猝滅
2.靜態(tài)猝滅（組成化合物的猝滅）
3.轉(zhuǎn)入三重態(tài)的猝滅
4.發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的猝滅
5.熒光物質(zhì)的自猝滅
不論是哪種猝滅，增大熒光物質(zhì)的濃度均會(huì)使熒光猝滅效應(yīng)增強(qiáng)，從而導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)曲線向濃度軸彎曲，即使熒光強(qiáng)度降低。
著名的熄滅劑:
① 鹵素離子
?、?重金屬離子
?、?氧分子
?、?硝基化合物
影響熒光強(qiáng)度的因素
1.溶劑
溶劑的影響可分為一般溶劑效應(yīng)和特殊溶劑效應(yīng)。
2.溫度
低溫下測定，提高靈敏度。
3.溶液pH值
大多數(shù)含有酸性或堿性基團(tuán)的芳香族化合物的熒光性質(zhì)受溶液pH的影響很大。
共軛酸堿對(duì)是具有不同熒光性質(zhì)的兩種型體，具有各自的熒光效率和熒光波長。
4.內(nèi)濾光作用和自吸收現(xiàn)象
溶液中若存在能吸收激發(fā)或熒光光能的物質(zhì)，就會(huì)使熒光減弱，這種現(xiàn)象稱為“內(nèi)濾光作用”。在溶液濃度較大時(shí)，一部分熒光發(fā)射被自身吸收，產(chǎn)生“自吸收”現(xiàn)象而降低了溶液的熒光強(qiáng)度。
熒光分析儀
1.光源
2.兩個(gè)單色器 (用于選擇激發(fā)光波長和熒光波長)
3.液槽
4.檢測器
5.信號(hào)顯示記錄器
由光源發(fā)射的光經(jīng)第一單色器得到所需的激發(fā)光波長，通過樣品池后，一部分光能被熒光物質(zhì)所吸收，熒光物質(zhì)被激發(fā)后，發(fā)射熒光。為了消除入射光和散射光的影響，熒光的測量通常在與激發(fā)光成直角的方向上進(jìn)行。
為消除可能共存的其它光線的干擾，如由激發(fā)所產(chǎn)生的反射光、Raman光,以及為將溶液中雜質(zhì)濾去，以獲得所需的熒光，在樣品池和檢測器之間設(shè)置了第二單色器。熒光作用于檢測器上，得到響應(yīng)的電信號(hào)。
分子熒光分析法的特點(diǎn)
1. 靈敏度高
熒光強(qiáng)度隨激發(fā)光強(qiáng)度增強(qiáng)而增強(qiáng)（提高激發(fā)光強(qiáng)度，可提高熒光強(qiáng)度）。
采用高靈敏度的檢測系統(tǒng)可大大提高靈敏度，熒光分析法的檢測限比分光光度法低2~4個(gè)數(shù)量級(jí)。
2. 選擇性好
不同的物質(zhì)用不同的光進(jìn)行激發(fā)，選擇不同的激發(fā)光波長。
不同的物質(zhì)發(fā)射的熒光不同，選擇不同的檢測熒光波長。
比較容易排除其它物質(zhì)的干擾，選擇性好。
3. 實(shí)驗(yàn)方法簡單
4. 待測樣品用量少；儀器價(jià)格適中。
發(fā)光強(qiáng)度可定量測定許多痕量的無機(jī)物和有機(jī)物，廣泛應(yīng)用在生物化學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)及農(nóng)牧產(chǎn)品分析、衛(wèi)生檢疫等領(lǐng)域。
熒光法比磷光法應(yīng)用廣泛，不如分光光度法。
局限性：主要是因?yàn)槟馨l(fā)熒光的物質(zhì)不具普遍性、增強(qiáng)熒光的方法有限、外界環(huán)境對(duì)熒光量子效率影響大、干擾測量的因素較多。
熒光分析法的應(yīng)用
1.定量分析
（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線法——最常用的定量分析方法。
?。?）熒光猝滅法
?。?）比較法
2.無機(jī)化合物的分析
無機(jī)化合物中，能直接產(chǎn)生熒光并應(yīng)用于測定的為數(shù)不多，但與有機(jī)化合物生成發(fā)熒光的有機(jī)配合物后，進(jìn)行熒光分析的元素達(dá)70多種，其中較常采用熒光法測定的元素有：Be、Al、B、Ga、Se、Mg、Zn、Cd及某些稀土元素。
3.有機(jī)化合物的分析
脂肪族有機(jī)化合物的分子結(jié)構(gòu)較為簡單，本身能發(fā)熒光的很少，一般需要與某些試劑反應(yīng)后才能進(jìn)行熒光分析。
芳香族化合物因具有共軛的不飽和體系，多數(shù)能發(fā)熒光；可直接用熒光法測定。對(duì)于具有致癌活性的多環(huán)芳烴——熒光分析法是最主要的測定方法。
為提高測定的靈敏度，有時(shí)也將芳香族化合物與適當(dāng)試劑反應(yīng)之后進(jìn)行測定。
可測定結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大量有機(jī)物質(zhì)，如：各種維生素、葉綠素、氨基酸、蛋白質(zhì)、酶和輔酶
以及各種藥物、毒物和農(nóng)藥等。
磷光分析法的應(yīng)用
能產(chǎn)生磷光的物質(zhì)數(shù)量很少，磷光分析不及熒光分析普遍，但磷光分析法已在藥物分析、臨床及環(huán)境分析領(lǐng)域得到一定的應(yīng)用。
低溫磷光分析已應(yīng)用在萘、蒽、菲、芘、苯并芘等多環(huán)芳烴及含O、S、N的雜環(huán)化合物分析。
固體表面室溫磷光分析法已成為多環(huán)芳烴和雜環(huán)化合物的快速、靈敏的分析手段。
