核酸探針雜交檢測技術(shù)介紹
預(yù)雜交的目的是用非特異性 DNA 分子(鮭精 DNA 或小牛胸腺 DNA)及其他高分子化合物(Denhart’s溶液)將待測核酸分子中的非特異性位點封閉,以避免這些位點與探針的非特異性結(jié)合。雜交反應(yīng)是使單鏈核酸探針與固定在膜上的待測核酸單鏈在一定溫度和條件下進行復(fù)性反應(yīng)的過程。雜交反應(yīng)結(jié)束后,應(yīng)進行洗膜處理以洗去非特異性雜交以及未雜交的標記探針,以避免干擾特異性雜交信號的檢測。膜洗凈后,將繼續(xù)進行雜交信號的檢測。
以放射性標記探針與固定在 NC 膜上的核酸進行雜交為例,雜交反應(yīng)的操作如下。
1、配制所需試劑
SSC 溶液(20×):3mol/L NaCl,0.3mol/L 檸檬酸鈉。
Denhardt’s溶液(50×):聚蔗糖5g,聚乙烯吡咯烷酮5g,牛血清白蛋白(BSA)5g,加水至500mL。
預(yù)雜交液:6×SSC,5×Denhardt’s溶液,0.5%SDS,100μg/mL 經(jīng)變性或斷裂成片段的鮭精 DNA。
2、操作步驟
(1)將含靶核酸的 NC 膜漂浮于6×SSC 液面,使其由下至上完全濕潤,并繼續(xù)浸泡2min。
(2)將濕潤的 NC 膜裝入塑料袋中,按0.2mL/cm2?的量加入預(yù)雜交液,盡可能擠出氣泡,將袋封口,置68℃水浴1～2h 或過夜。
(3)將雙鏈探針做變性處理使成單鏈,即于100℃加熱5min,然后立即置冰浴使驟冷。
(4)從水浴中取出雜交袋,剪去一角,將單鏈探針加入,盡可能將袋內(nèi)空氣擠出去,重新封口,并將雜交袋裝入另一個干凈的袋內(nèi),封閉,以防放射性污染。
(5)將雜交袋浸入68℃水浴,溫育8～16h。
(6)取出雜交袋,剪開,取出濾膜迅速浸泡于大量2×SSC 和0.5%SDS 中,室溫振蕩5min,勿使濾膜干燥。
(7)將 NC 膜移入盛有大量2×SSC 和0.1%SDS 溶液的容器中,室溫漂洗15min。
(8)將 NC 膜移入一盛有大量0.1×SSC 和0.5%SDS 溶液的容器中,37℃漂洗30min 至1h。
(9)將 NC 膜移入一盛有新配0.1×SSC 和0.5%SDS 溶液的容器中,68℃漂洗30min 至1h。
(10)取出濾膜,用0.1×SSC 室溫稍稍漂洗,然后置濾紙上吸去大部分液體,待做雜交信號的檢測。
當探針是放射性標記時,雜交信號的檢測通過放射自顯影進行。即利用放射線在X光片上的成影作用來檢測雜交信號。操作時,在暗室內(nèi)將濾膜與增感屏、X 光片依序放置暗盒中,再將暗盒置-70℃條件下曝光適當時間,取出 X 光片,進行顯影和定影處理。
對于非放射性標記的探針,則需將非放射性標記物與檢測系統(tǒng)偶聯(lián),再經(jīng)檢測系統(tǒng)的顯色反應(yīng)來檢測雜交信號。以地高辛的堿性磷酸酶檢測反應(yīng)為例,地高辛(Dig)是一種半抗原,雜交反應(yīng)結(jié)束后,可加入堿性磷酸酶標記的抗 Dig 抗體,使其在膜上的雜交位點形成酶標抗體 Dig 復(fù)合物,再加入酶底物如氮藍四唑鹽(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚酚磷酸甲苯胺鹽(BCIP),在酶促作用下,底物開始顯藍紫色。其基本反應(yīng)程序類似ELISA,雜交信號的強弱,通過底物顯色程度的深淺、有無來確定。
