SYBR Green法實時定量PCR優(yōu)化攻略
SYBR? Green是一種插入DNA分子的染料，具有多種分子生物學(xué)應(yīng)用，其中之一就是用于實時定量PCR（qPCR）。隨著PCR循環(huán)的連續(xù)進(jìn)行，這種染料的熒光強度會不斷增強，從而可以使人們對反應(yīng)中的DNA進(jìn)行定量。SYBR Green法及一些其他基于染料的qPCR方法比探針法的成本低，使用也更為方便。不過這些方法也存在著與生俱來的弊端，SYBR Green方法產(chǎn)生的非特異性產(chǎn)物較多，會導(dǎo)致高背景和假陽性。盡管如此，SYBR Green法這一久經(jīng)考驗的技術(shù)仍然頗為流行，有大量的研究人員是SYBR Green法的忠實擁護(hù)者，愿意接受這一技術(shù)的小瑕疵。當(dāng)然供應(yīng)商們也各展所長，開發(fā)了各式各樣的產(chǎn)品來幫您優(yōu)化這一qPCR的經(jīng)典方法。
熱啟動的長處
熱啟動PCR方法能夠在反應(yīng)開始前避免非特異性擴增。熱啟動技術(shù)一般是依賴經(jīng)修飾的酶、引物或者抗體對聚合酶進(jìn)行抑制，直到系統(tǒng)達(dá)到變性溫度。
Sigma公司生命科學(xué)部qPCR試劑全球產(chǎn)品Eric Reyes稱，該公司zui新的熱啟動產(chǎn)品KiCqStart? SYBR Green qPCR ReadyMix?比同類產(chǎn)品性能更優(yōu)，并且可以針對如今試驗室中的各類實時定量PCR儀提供相應(yīng)配方的產(chǎn)品。KiCqStart SYBR Green ReadyMix產(chǎn)品是2X濃度的即用型試劑，包括SYBR Green I、抗體介導(dǎo)的熱啟動Taq?DNA聚合酶、核苷酸和MgCl2，外加緩沖液和穩(wěn)定劑。該產(chǎn)品只需客戶加入引物和模版，免去了繁復(fù)的SYBR Green優(yōu)化流程，實際上該產(chǎn)品也的確不需要進(jìn)行優(yōu)化。
較難擴增的目標(biāo)
有些目標(biāo)較難擴增，為了解決這一問題，Life Technologies公司近期發(fā)布了SYBR Select Master Mix。依據(jù)Life Technologies基因分析產(chǎn)品主管Sobha Pisharody的說法，該產(chǎn)品的zui大優(yōu)勢在于特異性和可重復(fù)性更高，超越了目前市面上的其他SYBR混合液。SYBR Select包括一個熱不穩(wěn)定性尿嘧啶糖基化酶UDG，用于去除可能干擾擴增的污染模板?！盎旌弦褐泻蠻DG可能造成一些問題，”Pisharody說?！坝袝r甚至?xí)茐姆磻?yīng)，因為它并不總能一受熱就滅活?！?/p>
dUTP的利與弊
擴增產(chǎn)物有時會影響后續(xù)PCR反應(yīng)，導(dǎo)致假陽性結(jié)果?？刂七@種情況的方法之一就是在PCR產(chǎn)物中用dUTP取代dTTP，隨后再用UDG處理所有的后續(xù)反應(yīng)。UDG能夠?qū)⒛蜞奏钠淞姿岫ブ鞲缮锨谐聛?，但不影響天然DNA。
熱不穩(wěn)定性UDG在完成清理任務(wù)后，可以受熱自動失活。“這一產(chǎn)品能使客戶的實驗更容易獲得成功，”Pisharody說?！翱蛻羰褂肧YBR遇到的主要問題之一，是需要反復(fù)進(jìn)行引物設(shè)計、試驗、重新設(shè)計引物，而這一混合液的特異性可以幫助人們大大簡化這一過程。”
不過，dUTP方法也存在著缺陷。只有當(dāng)同一個儀器上的所用用戶都使用dUTP清理系統(tǒng)時，該方法才有效。即使該研究組中只有一位成員不使用dUTP清理系統(tǒng)，這種控制方法就會失效。此外使用dUTP被認(rèn)為是一種低效率的方法，因為dUTP會使反應(yīng)的效率降低，Ct值增大。
Meridian生命科學(xué)公司旗下的Bioline就因此不再銷售帶有dUTP的PCR試劑盒。該公司向用戶推薦了一種優(yōu)化步驟，包括使用一次性耗材、帶過濾芯的吸頭以及分隔擴增區(qū)域，將潔凈的實驗室操作與高特異性的實時定量PCR起來。Bioline的SensiFAST?系列試劑盒不僅提供用于SYBR Green法的實時定量PCR產(chǎn)品，同樣也提供探針法產(chǎn)品供您選擇。
快、還要更快
目前，許多實驗室都在尋求qPCR的快速方案，例如將兩小時的實驗方案縮短至45分鐘或者1小時。快速PCR通常意味著價格水漲船高的儀器和不菲的資金投入，不過其實調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)儀器的參數(shù)也能夠?qū)崿F(xiàn)快速PCR，例如可將qPCR的標(biāo)準(zhǔn)三步流程合并為兩步（合并退火和延伸過程）。而相應(yīng)的試劑和耗材（例如新型熱啟動酶）也能幫您進(jìn)一步節(jié)省時間。
Bio-Rad公司的SsoAdvanced? SYBR Green supermix中包含與雙鏈DNA結(jié)合的蛋白Sso7d融合酶，這種酶能夠穩(wěn)定聚合酶-模板復(fù)合物，提高PCR反應(yīng)的持續(xù)合成能力、抑制劑耐受力和反應(yīng)速度。Bio-Rad的資料顯示，這一混合液能夠提高qPCR的速度而不會對反應(yīng)的特異性、敏感性和效率產(chǎn)生絲毫影響。
此外，Bio-Rad公司還提供iTaq? Universal SYBR Green Supermix?！斑@種SYBR Green supermix的優(yōu)勢在于，它的儀器兼容性非常廣泛，并且能夠在多種反應(yīng)條件下生成優(yōu)異的qPCR數(shù)據(jù)，”Bio-Rad 的PCR試劑產(chǎn)品Ramesh Sathiyaa介紹道。
Thermo Scientific公司的DyNAmo? Flash SYBR Green qPCR試劑盒也是一款專門為快速PCR設(shè)計的產(chǎn)品。該產(chǎn)品依賴于經(jīng)過修飾的Thermus brockianus DNA聚合酶，將這種酶的熱啟動版與SYBR Green I染料相結(jié)合。該公司的技術(shù)人員通過非特異性DNA結(jié)合域的融合使T. brockianus聚合酶更加穩(wěn)定性，并且在室溫下不具活性。該試劑盒的ColorFlash版更整合了特殊染料，其中master mix含有藍(lán)色染料針，而樣品緩沖液含黃色染料（樣品孔），這樣當(dāng)樣品和master mix混合后就會呈現(xiàn)綠色。這一顏色體系可以確保移液的正確性，幫您輕松告別加樣失誤。
替代品
羅氏公司的技術(shù)服務(wù)顧問Joe Donnehoffer正在嘗試引導(dǎo)客戶放棄SYBR Green，“如果客戶正在使用SYBR Green并且需求用于降低非特異性的產(chǎn)品，我們會推薦他們使用UPL通用探針庫”。
Donnehoffer還向強烈執(zhí)著于SYBR Green的客戶推薦了一款替代性染料，LightCycler 480 ResoLight Dye。與SYBR Green不同，ResoLight能夠充滿DNA分子片段，生成準(zhǔn)確的熔解曲線。而SYBR Green I分子就無法做到這一點，染料分子在解鏈階段會在DNA鏈之間“跳躍”。
Donnehoffer也提到人們對于SYBR Green的偏愛可能較難改變。“使用SYBR Green的客戶……并不情愿采用另一種不同的方法?！币虼?，他也并不指望SYBR Green會在近期退出實驗室的應(yīng)用舞臺。
Life Technologies公司也有相應(yīng)的替代性染料提供，該公司的SYBR GreenER?比SYBR Green I更亮，對PCR反應(yīng)的抑制也更小。
預(yù)證引物
正所謂成也蕭何敗蕭何，引物設(shè)計在一個qPCR實驗中非常關(guān)鍵。實際上您可以在引物數(shù)據(jù)庫中尋找適合自己的引物設(shè)計，這類數(shù)據(jù)庫包括RTPrimerDB、PrimerBank和qPrimerDepot等，其中的引物設(shè)計都是被驗證過的。
市面上也有不少預(yù)證引物的產(chǎn)品。例如Qiagen公司的QuantiTect Primer Assay就是特別為SYBR Green法設(shè)計的qPCR引物對，具有高度的敏感性和特異性，PCR效率能達(dá)到100%。該產(chǎn)品系列覆蓋了人類、大鼠、小鼠、果蠅、擬南芥等物種的基因，更經(jīng)過專家的反復(fù)驗證和優(yōu)化，與Qiagen公司的QuantiFast、QuantiTect、Rotor-Gene或者FastLane SYBR Green試劑盒一同使用實驗結(jié)果就更有保障了。根據(jù)Qiagen公司的資料，即使在標(biāo)準(zhǔn)qPCR儀上使用，QuantiFast SYBR Green試劑盒也能幫您省下60%的時間。
OriGene公司也有預(yù)證引物產(chǎn)品提供，其SensiMix qPCR引物對就能用于SYBR Green法qPCR，該產(chǎn)品也是OriGene公司獨有算法的結(jié)晶。OriGene公司的預(yù)證引物產(chǎn)品覆蓋了人類和小鼠的整個基因組。
此外，Sigma公司也發(fā)布了為人類、小鼠和大鼠轉(zhuǎn)錄組設(shè)計的KiCqStart預(yù)證引物，Sigma公司OEM、分子診斷和qPCR探針的全球產(chǎn)品Tom Russell介紹道。這些引物比市面上的其他預(yù)證引物更經(jīng)濟(jì)，購買該產(chǎn)品也更為便利，“我們在世界各地都設(shè)有生產(chǎn)機構(gòu)，”Russell說。
在qPCR復(fù)雜冗長的優(yōu)化過程中，往往需要不斷進(jìn)行實驗，逐步改進(jìn)引物設(shè)計，甚至重復(fù)訂購試劑，不知不覺就耗費了我們大量的時間和精力，從這方面看預(yù)證引物和試劑盒絕對是物超所值。
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綜述
