質(zhì)粒DNA瓊脂糖凝膠電泳圖該怎么分析
一、實驗名稱：質(zhì)粒DNA的提取與純化，DNA瓊脂糖凝膠電泳 二、實驗原理： 1.質(zhì)粒DNA的提取： 質(zhì)粒是一類存在于幾乎所有細菌等微生物中染色體之外（細胞質(zhì)中）呈游離狀態(tài)的雙鏈、閉環(huán)的DNA分子，能夠自主復(fù)制和穩(wěn)定遺傳，以超螺旋形式存在，是最常用的基因克隆載體。除質(zhì)粒外，大腸桿菌中還含有基因組DNA、各種RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等物質(zhì)，因此需要裂解細胞并除去蛋白質(zhì)和染色體DNA等物質(zhì)才能分離純化出質(zhì)粒DNA。分離制備質(zhì)粒DNA的方法很多，其中常用的方法有堿裂解法、煮沸法、SDS法、羥基磷灰石層析法等。在實際操作中可以根據(jù)宿主菌株類型、質(zhì)粒分子大小、堿基組成和結(jié)構(gòu)等特點以及質(zhì)粒DNA的用途進行選擇。本實驗使用堿裂解法，即利用SolutionⅠ 、Ⅱ、Ⅲ三種溶液分離提取質(zhì)粒DNA.其原理如下。 （1）堿裂解法提取大腸桿菌質(zhì)粒DNA的原理： 堿裂解法提取質(zhì)粒DNA是根據(jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA和線性染色體DNA之間變性與復(fù)性的差異來分離質(zhì)粒DNA，達到分離提純質(zhì)粒DNA的目的。在pH值高達12.6的堿性條件下，線性的DNA因氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性，盡管在這樣的條件下，共價閉環(huán)質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵會被斷裂，但超螺旋共價閉合環(huán)狀的兩條互補鏈相互纏繞，不會完全分離。當加入pH4.8乙酸鉀高鹽緩沖液恢復(fù)pH至中性時，共價閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA復(fù)性，恢復(fù)其天然構(gòu)象，以可溶狀態(tài)存在于液相中；而線性的染色體DNA由于兩條互補鏈彼此已完全分開、分子量大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜而相互纏繞形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。與不穩(wěn)定的大分子RNA、變形的蛋白質(zhì)以及細菌碎片等一起沉淀而被除去。進一步用酚、氯仿使蛋白質(zhì)變性去除蛋白質(zhì)雜質(zhì)，然后用無水乙醇沉淀，即可獲得純化的質(zhì)粒DNA。SolutionⅠ 、Ⅱ、Ⅲ三種溶液以及無水乙醇沉淀DNA的具體作用和原理如下。 （2）四種溶液作用及原理： ①Solution I的作用：懸浮大腸桿菌菌體，增加溶液的粘度，維持滲透壓及防止DNA受機械剪切力作用而降解。EDTA是Ca2+和Mg2+等二價金屬離子的螯合劑，在溶液I中加入EDTA，是要把大腸桿菌細胞中的二價金屬離子都螯合掉，從而起到抑制DNA酶對DNA的降解和抑制微生物生長的作用。另外也可保證溶菌酶活性。 ②Solution II的作用：提供堿性條件，pH高達12.6，使大腸桿菌瞬間裂解，促使染色體DNA和質(zhì)粒DNA變性。所含離子型表面活性劑十二烷基酸鈉（SDS）可使細胞膜、核膜發(fā)生破裂，充分溶解膜蛋白。同時，磺酸基與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物而變形沉淀。 ③Solution III的作用：為KAc-HAc緩沖液。該溶液所含有的高濃度鉀離子與溶液體系中的十二烷基磺酸鈉發(fā)生反應(yīng)形成十二烷基磺酸鉀，從而將與之結(jié)合的絕大部分大腸桿菌蛋白質(zhì)以及很長的基因組DNA一起沉淀，與質(zhì)粒分離開來；另外溶液III所含有的醋酸中和溶液Ⅱ的強堿性，使pH降至中性，因為長時間的堿性條件會打斷DNA；基因組DNA一旦發(fā)生斷裂，只要是50-100kb大小的片段，就沒有辦法再被PDS共沉淀，這樣就跟質(zhì)粒DNA共存了。而且在整個質(zhì)粒DNA的提取過程中，沉淀DNA時用無水乙醇及在高鹽、低溫條件下進行都是為了用化學或物理手段將基因組DNA分子和蛋白質(zhì)發(fā)生變性、在體系中的溶解度降低，較充分的分離提純出實驗所需的質(zhì)粒DNA
