凝集反應(yīng)實(shí)驗(yàn)原理和方法（直接凝集反應(yīng)和間接凝集...(2)
（一）正向間接血凝試驗(yàn)
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將綿羊紅細(xì)胞或人的“ O”型紅細(xì)胞用醛類固定（稱為醛化，可改變血球表面性質(zhì)，使其易于吸附蛋白質(zhì)類抗原，并可長(zhǎng)期保存使用），再將可溶性抗原吸附于醛化的血細(xì)胞上，制成抗原致敏的紅細(xì)胞，當(dāng)與相應(yīng)的抗體結(jié)合，使紅細(xì)胞被動(dòng)的聚合在一起，出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集現(xiàn)象，常用于檢測(cè)傳染病抗體或自身抗體。
【 實(shí)驗(yàn)材料 】
（ 1）抗原制備：將傷寒桿菌接種在培養(yǎng)基上，37oC培養(yǎng)24小時(shí)，用生理鹽水洗下，100oC水浴2小時(shí)，離心棄上清，稀釋后備用。
（ 2）致敏紅細(xì)胞的制備：取稀釋的抗原與等體積的已醛化的2%SRBC混合，37oC水浴2小時(shí)，每隔15分鐘振搖一次，取出后洗滌棄上清，稀釋成0.5% 備用。
（ 3）試管、試管架、刻度吸管、恒溫水浴箱。
【 實(shí)驗(yàn)方法 】
（ 1）取8支小試管排列于試管架上，依次編號(hào)。每管加入0.25ml生理鹽水。于第1管內(nèi)加入1:10稀釋的免疫血清0.25ml混勻，倍比稀釋至第7管。第8管為陰性對(duì)照。
（ 2）每管中加入0.25ml致敏綿羊紅細(xì)胞，振搖試管架，使之充分混勻。
（ 3）將試管架靜置于37oC恒溫水浴箱中1小時(shí)。
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正向間接血凝試驗(yàn)操作程序
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【 結(jié)果分析 】
（ 1）首先觀察陰性對(duì)照管，應(yīng)無(wú)凝集現(xiàn)象，管底紅細(xì)胞沉積呈圓形，邊緣整齊，輕輕搖動(dòng)則沉積菌分散均勻呈混濁現(xiàn)象。
（ 2）觀察實(shí)驗(yàn)管，凝集現(xiàn)象可根據(jù)強(qiáng)弱程度，分為五級(jí)：
++++ 細(xì)菌全部凝集，管底形成大片凝集物。
+++ 細(xì)菌大部分凝集，管底的片狀凝集物較小而薄。
++ 約半數(shù)的細(xì)菌發(fā)生凝集，管底出現(xiàn)凝集環(huán)。
+ 僅有少部分細(xì)菌凝集，管底可見(jiàn)沉積的細(xì)菌周邊有稀疏、點(diǎn)狀的凝集物。
— 液體混濁，無(wú)凝集。
（ 3）血清抗體效價(jià)的判定：以出現(xiàn)明顯凝集現(xiàn)象（++）的血清最高稀釋度作為受檢血清的抗體效價(jià)。
【 注意事項(xiàng) 】
? 紅細(xì)胞需來(lái)自同一個(gè)體、批號(hào)相同，且致敏血球應(yīng)新鮮配置。
? 使用器材必須清潔，否則對(duì)結(jié)果有很大影響。
（二）反向間接血凝試驗(yàn)
將特異性抗體吸附于醛化的紅細(xì)胞上，再與相應(yīng)抗原結(jié)合，在適量電解質(zhì)存在條件下，紅細(xì)胞被動(dòng)聚集出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)凝集現(xiàn)象。用于檢測(cè)標(biāo)本中的相應(yīng)可溶性抗原。
【 實(shí)驗(yàn)材料 】
（ 1）1:20抗—HBs致敏的醛化血球、純化的1:20抗—HBs、待檢血清、稀釋液。
（ 2）“V”型微量血凝板，0.025ml稀釋棒、微量攪拌器、刻度吸管、滴管（40滴/ml）。
【 實(shí)驗(yàn)方法 】
（ 1）配制致敏血球懸液 于每瓶?jī)龈稍\斷血球加4ml稀釋液，輕輕旋搖使成均勻血球懸液，濃度約為0.6%。
（ 2）正式試驗(yàn)
① 在“V”型微量血凝板上，每份待檢血清設(shè)立8孔，于各孔內(nèi)用40滴/ml滴管各加1滴稀釋液（相當(dāng)于0.025ml）。
② 用0.025ml容量的稀釋棒蘸滿待檢查血清分別依次在各孔內(nèi)捻轉(zhuǎn)作倍比稀釋（一般每孔內(nèi)均需捻轉(zhuǎn)10次左右），直至第7孔，第8孔為致敏血球?qū)φ?。另設(shè)第9孔為陽(yáng)性對(duì)照，加0.025mlHBsAg陽(yáng)性血清。
③ 于每孔中加0.025ml混勻的致敏血球懸液。
④ 將血凝板置于微型振蕩器上振蕩1~2分鐘，置37oC1小時(shí)后觀察結(jié)果。
反向間接血凝試驗(yàn)操作程序
【 結(jié)果分析 】
不凝集：紅細(xì)胞全部下沉，集中于孔底，形成致密的圓點(diǎn)。
明顯凝集（++）：紅細(xì)胞于孔底形成薄膜狀凝集，中央可見(jiàn)疏松的紅點(diǎn)。
出現(xiàn)明顯凝集的血清最高稀釋度為 HBsAg效價(jià)，凡效價(jià)≥1:16者需進(jìn)一步做中和試驗(yàn)。
中和試驗(yàn)
在血凝板上每份標(biāo)本設(shè)測(cè)定排與對(duì)照排，每排
8孔。于每孔加稀釋液0.025ml，用2支稀釋棒蘸取被檢血清，分別在2排作倍比稀釋到第7孔，第8孔不含血清，為血球?qū)φ?，然后，于測(cè)定排各孔加稀釋液0.025ml，對(duì)照排各孔加1:20抗HBsAg0.025ml，血凝板振蕩1~2分鐘，置37oC30分鐘。取出，于各孔加0.025ml致敏血球，振搖混勻，置37oC1小時(shí)后觀察結(jié)果。
凡正式試驗(yàn)效價(jià)≥ 1:16，且中和試驗(yàn)的對(duì)照排凝集孔數(shù)至少低于測(cè)定排凝集孔數(shù)2孔者，為HBsAg陽(yáng)性，否則系非特異性凝集。
【 注意事項(xiàng) 】
（ 1）配制的致敏血球懸液一般當(dāng)天用完，若置2~10oC，使用期不超過(guò)3天。
（ 2）試驗(yàn)用的血凝板、滴管、稀釋棒等器材必須十分清潔，否則易造成非特異性凝集。
? 血凝板、稀釋棒用后均需用次氯酸鈉（ 10%v/v）浸泡過(guò)夜；滴管需煮沸10分鐘，然后用水沖凈，再用蒸餾水沖洗，晾干備用。
