固定化酶的制備方法
固定化酶的制備方法有物理法和化學(xué)法兩大類。
物理方法包括物理吸附法、包埋法等。物理法固定酶的優(yōu)點(diǎn)在于酶不參加化學(xué)反應(yīng),整體結(jié)構(gòu)保持不變,酶的催化活性得到很好保留。但是,由于包埋物或半透膜具有一定的空間或立體阻礙作用,因此對(duì)一些反應(yīng)不適用。
化學(xué)法包括結(jié)合法、交聯(lián)法。結(jié)合法又分為離子結(jié)合法和共價(jià)結(jié)合法。是將酶通過化學(xué)鍵連接到天然的或合成的高分子載體上,使用偶聯(lián)劑通過酶表面的基團(tuán)將酶交聯(lián)起來,而形成相對(duì)分子量更大、不溶性的固定化酶的方法.
其中吸附法和共價(jià)鍵法又可統(tǒng)稱為載體結(jié)合法。
具體方法
吸附法
利用各種吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上而使酶固定的方法。通常有物理吸附法和離子吸附法。
常用吸附劑有活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等。
采用吸附法固定酶，其操作簡(jiǎn)便、條件溫和，不會(huì)引起酶變性或失活，且載體廉價(jià)易得，可反復(fù)使用。
載體結(jié)合法
最常用的是共價(jià)結(jié)合法，即酶蛋白的非必需基團(tuán)通過共價(jià)鍵和載體形成不可逆的連接。在溫和的條件下能偶聯(lián)的蛋白質(zhì)基團(tuán)包括：氨基、羧基、半胱氨酸的巰基、組氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、絲氨酸和蘇氨酸的羥基。參加和載體共價(jià)結(jié)合的基團(tuán)，不能是酶表現(xiàn)活力所必需的基團(tuán)。以中國首先采用的雙功能團(tuán)試劑“對(duì)位-β-硫酸酯乙砜基苯胺”偶聯(lián)載體和酶為例，載體結(jié)合的步驟如下頁反應(yīng)式。
此法曾先后用于3′-核糖核酸酶、5′-磷酸二酯酶和葡萄糖淀粉酶等的固定化。此外酶通過物理吸附或離子吸附于載體制備固定化酶也是常用的方法。
交聯(lián)法
依靠雙功能團(tuán)試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)凝集成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使之不溶于水從而形成固定化酶。常采用的雙功能團(tuán)試劑有戊二醛、順丁烯二酸酐等。酶蛋白的游離氨基、酚基、咪唑基及巰基均可參與交聯(lián)反應(yīng)。
包埋法
酶被裹在凝膠的細(xì)格子中或被半透性的聚合物膜包圍而成為格子型和微膠囊型兩種。包埋法制備固定化酶除包埋水溶性酶外還常包埋細(xì)胞，制成固定化細(xì)胞，例如可用明膠及戊二醛包埋具有青霉素?；富盍Φ木w，可連續(xù)水解帤基青霉素，工業(yè)生產(chǎn)6-氨基青霉烷酸。
酶經(jīng)過固定化后，比較能耐受溫度及pH的變化，最適pH往往稍有移位，對(duì)底物專一性沒有任何改變，實(shí)際使用效率提高幾十倍（如5′-磷酸二酯酶的工業(yè)應(yīng)用）甚至幾百倍（如青霉素?；傅墓I(yè)應(yīng)用）。
