分子病理診斷的現(xiàn)狀與思考
分子病理診斷，是指應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，從基因水平上檢測細(xì)胞和組織的分子遺傳學(xué)變化，以協(xié)助病理診斷和分型、指導(dǎo)靶向治療、預(yù)測治療反應(yīng)及判斷預(yù)后的一種病理診斷技術(shù)，是分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)的理論在臨床病理中的應(yīng)用，屬轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的范疇。分子病理診斷又稱分子病理檢查、分子病理檢測、分子病理技術(shù)，稱謂比較混亂。我們認(rèn)為，如果強(qiáng)調(diào)結(jié)果(即與疾病的關(guān)系)，稱分子病理診斷較好，例如分子病理診斷報(bào)告；如強(qiáng)調(diào)過程，稱分子病理檢查或分子病理檢測較合適；如強(qiáng)調(diào)方法，稱分子病理技術(shù)較恰當(dāng)。從本質(zhì)上講，凡是基于組織和細(xì)胞分子水平上的疾病診斷都是分子病理診斷，這是廣義的分子病理診斷，如免疫組化診斷。但目前公認(rèn)的是狹義的分子病理診斷，即基于細(xì)胞或組織基因水平的病理診斷。本文中就國內(nèi)分子病理診斷的現(xiàn)狀、存在的問題和應(yīng)對策略進(jìn)行探討。
1、我國分子病理診斷發(fā)展概況
我國的分子病理診斷基本上與國外同步發(fā)展。國內(nèi)最早的分子病理診斷當(dāng)首推20世紀(jì)80年代的DNA原位雜交。當(dāng)時(shí)王泊云等用32P標(biāo)記HBV-DNA作探針，在組織切片上進(jìn)行雜交反應(yīng)，通過堿基互補(bǔ)原理檢測肝炎和肝癌組織中的HBV感染。隨后出現(xiàn)的是Southern雜交檢測T細(xì)胞受體基因和免疫球蛋白基因重排，目的是鑒定T細(xì)胞或B細(xì)胞的單克隆性增生以早期診斷淋巴瘤。之后，隨著越來越多的腫瘤相關(guān)基因被發(fā)現(xiàn)，一系列用于檢測癌基因激活和抑癌基因失活的分子病理技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，如p53基因突變檢測、K-ras基因突變檢測等。本世紀(jì)初，腫瘤靶向藥物被用于臨床，靶向治療催生了靶向診斷(又叫藥物伴隨診斷)，一批用于檢測靶向治療藥物靶點(diǎn)的分子病理技術(shù)迅速問世，如FISH檢測乳腺癌HER2基因擴(kuò)增、ARMS法檢測肺癌EGFR基因突變等?，F(xiàn)在全國省級(jí)以上醫(yī)院、解放軍各總醫(yī)院、軍醫(yī)大學(xué)教學(xué)醫(yī)院基本上都開展了分子病理診斷。因此，最近10年是分子病理診斷蓬勃發(fā)展的時(shí)期。病理人家收集整理
但我國的分子病理診斷在普及程度、認(rèn)知程度和規(guī)范化程度上與國外相比卻有較大差距。為了盡快與國際接軌，各有關(guān)部門和病理專家做了不懈努力。衛(wèi)生部病理質(zhì)控評價(jià)中心于2011年11月成立了分子病理質(zhì)控組，并于廣州召開了第一次工作會(huì)議。該質(zhì)控組由復(fù)旦大學(xué)腫瘤醫(yī)院病理科杜祥教授擔(dān)任組長，主要任務(wù)是指導(dǎo)全國分子病理室的規(guī)范化建設(shè)，組織分子病理診斷質(zhì)控。迄今為止，已召開5次工作會(huì)議，開展了一系列卓有成效的工作，如建立了全國分子病理質(zhì)控網(wǎng)站，開展了2批EGFR基因突變檢測質(zhì)控評比，組織起草了《分子病理診斷實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)入基本要求(征求意見稿)》。全軍病理專業(yè)委員會(huì)也于2012年11月成立了分子病理專業(yè)組，舉辦了多期分子病理學(xué)習(xí)班，以此推動(dòng)全軍分子病理診斷。地方各省病理質(zhì)控中心也根據(jù)本地情況
陸續(xù)開展了分子病理質(zhì)控工作。
2、我國已經(jīng)開展的分子病理技術(shù)
目前，我國已穩(wěn)定開展的分子病理技術(shù)主要有顯色原位雜交、熒光原位雜交、PCR、熒光定量PCR、基因芯片和DNA測序技術(shù)。
2．1 顯色原位雜交??顯色原位雜交(chromogenic in situ hybridization，CISH)技術(shù)是分子生物學(xué)、組織化學(xué)及細(xì)胞學(xué)相結(jié)合產(chǎn)生的一門新興技術(shù)，是利用核酸分子單鏈問堿基互補(bǔ)的原理，將地高辛或生物素標(biāo)記的外源核酸探針與組織、細(xì)胞或染色體上待測DNA或RNA互補(bǔ)配對，結(jié)合成雙鏈雜交分子，通過過氧化物酶或堿性磷酸酶的呈色反應(yīng)將待測核酸在組織、細(xì)胞或染色體上的位置顯示出來。根據(jù)探針種類不同可分為DNA原位雜交和RNA原位雜交。DNA原位雜交主要用于基因定位、特異基因(如病原微生物基因)檢測等；RNA原位雜交則用于基因表達(dá)檢測。原位雜交技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是操作簡單，可直接定位組織，價(jià)格低廉，信號(hào)穩(wěn)定，儲(chǔ)存方便，可做組織學(xué)評價(jià)，是目前應(yīng)用較多的分子病理技術(shù)之一。
2．2 熒光原位雜交??熒光原位雜交(fluorescence in situhybridization，F(xiàn)ISH)技術(shù)基本原理與顯色原位雜交相同，不同之處在于FISH是應(yīng)用熒光素標(biāo)記的探針與組織細(xì)胞中待測核酸反應(yīng)形成雜交體，并采用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察信號(hào)表達(dá)。為了同時(shí)檢測多個(gè)靶位，在熒光原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來一種新技術(shù)，即多彩色熒光原位雜交(muhicolor fluorescence in situ hybridization，mFISH)。它用幾種不同顏色的熒光素單獨(dú)或者混合標(biāo)記的探針進(jìn)行原位雜交，能同時(shí)檢測多個(gè)基因，擴(kuò)大了FISH技術(shù)的臨床應(yīng)用。FISH技術(shù)目前主要應(yīng)用于染色體和DNA水平上的病理診斷檢測。染色體FISH主要檢測染色體易位、缺失、重復(fù)、變異等；DNA FISH主要是檢測基因突變、擴(kuò)增、易位、缺失。與原位雜交技術(shù)相比，F(xiàn)ISH更加安全、快速，特異性好、定位準(zhǔn)確。
2．3聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)??PCR技術(shù)是一種在生物體細(xì)胞外通過酶促合成特異DNA或DNA片段的方法。其原理是設(shè)計(jì)特異引物，在Taq DNA聚合酶催化作用下，經(jīng)過高溫變性、低溫退火和適溫延伸3個(gè)步驟反復(fù)循環(huán)，對某一特定模板的特定區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后應(yīng)用凝膠電泳或測序等方法分析產(chǎn)物。因此，該技術(shù)可以直接檢測疾病組織、細(xì)胞中是否存在某種病毒DNA，同時(shí)PCR技術(shù)還是基因突變檢測的前期必備技術(shù)。
2．4 熒光定量PCR 熒光定量PCR(real time-PCR)技術(shù)是近幾年基于普通PCR技術(shù)發(fā)展的一種新技術(shù)。它借助熒光信號(hào)來檢測PCR產(chǎn)物，通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異探針，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，在擴(kuò)增過程中，每經(jīng)過一次循環(huán)，熒光定量PCR儀就會(huì)收集一次熒光信號(hào)，實(shí)時(shí)檢測整個(gè)PCR進(jìn)程。用熒光定量PCR法檢測目的基因僅需檢測樣本是否具有擴(kuò)增信號(hào)即可，且PCR反應(yīng)具有核酸擴(kuò)增的高效性，可檢測出微小突變。根據(jù)探針標(biāo)記不同可分為TaqMan探針法和ARMS法。TaqMan探針法的關(guān)鍵是設(shè)計(jì)與模板特異性結(jié)合的熒光探針，該探針的5’端標(biāo)記有報(bào)告熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記有淬滅熒光基團(tuán)。當(dāng)探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收，儀器檢測不到信號(hào)。當(dāng)PCR擴(kuò)增時(shí)，TaqMan在鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針，其3’-5’外切酶活性將探針酶切降解，報(bào)告熒光基團(tuán)與淬滅熒光基團(tuán)分離，熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)。因此，每經(jīng)過一個(gè)PCR循環(huán)，就有一個(gè)熒光分子形成，熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物的形成有一個(gè)同步指數(shù)增長的過程，再通過實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程熒光信號(hào)的積累來檢測PCR產(chǎn)物。
ARMS法即擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)，也稱等位基因特異性PCR，含一對特殊引物(等位基因特異性引物)和一條TaqMan熒光探針。其原理是在DNA序列一端突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)2個(gè)引物，突變位點(diǎn)位于引物的3’端，一個(gè)相應(yīng)于正常等位基因序列引物，一個(gè)相應(yīng)于突變基因等位序列引物，再在DNA另一端設(shè)計(jì)一個(gè)共同引物。用PCR對突變基因進(jìn)行檢測時(shí)，只有與突變DNA完全互補(bǔ)的引物才可延伸并得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。該方法先通過等位基因特異性引物將DNA突變點(diǎn)富集；然后用設(shè)計(jì)的TaqMan熒光探針將富集的DNA突變點(diǎn)通過熒光信號(hào)的積累檢測出來。因此，ARMS法的靈敏度比TaqMan探針法更高，更容易從大量野生型DNA中選擇性富集低濃度的DNA突變。
2．5基因芯片??基因芯片又稱DNA芯片或DNA微陣列。其原理是在固體載體(硅片、玻片、硝酸纖維素膜)上按照特定的排列方式集成大量已知DNA／cDNA片段，形成DNA／cDNA微矩陣。將樣品分子DNA／RNA通過PCR／RT-PCR擴(kuò)增、體外轉(zhuǎn)錄等技術(shù)滲入熒光標(biāo)記分子后，與位于芯片上的已知序列雜交，最后通過掃描儀及計(jì)算機(jī)進(jìn)行綜合分析，比較不同熒光在各點(diǎn)陣的強(qiáng)度，即可獲得樣品中大量基因表達(dá)的信息。基因芯片技術(shù)固定的是已知探針，它能夠同時(shí)平行分析數(shù)萬個(gè)基因，進(jìn)行高通量篩選與檢測分析，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)核酸印跡雜交技術(shù)操作復(fù)雜、自動(dòng)化程度低、檢測目的分子數(shù)量少的不足。
基因芯片技術(shù)是一門新興的技術(shù)，由于該技術(shù)能在一次實(shí)驗(yàn)中自動(dòng)、快速、敏感地同時(shí)檢測數(shù)千條序列，而且獲得的序列信息高度特異、穩(wěn)定。根據(jù)探針類型分為DNA芯片和cDNA芯片，前者用于檢測基因突變，實(shí)現(xiàn)腫瘤早期診斷、判斷預(yù)后及治療；后者用于檢測基因表達(dá)，對腫瘤進(jìn)行發(fā)現(xiàn)性分類和預(yù)測性分類。病理人家收集整理
2．6 DNA測序??應(yīng)用于分子病理診斷的DNA測序技術(shù)有直接測序法和焦磷酸測序法。直接測序技術(shù)主要是Sanger等發(fā)明的雙脫氧鏈末端終止法。其原理就是根據(jù)核苷酸在某一固定的點(diǎn)開始，隨機(jī)在某一個(gè)特定的堿基處終止，產(chǎn)生A、T、C、G 4組不同長度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進(jìn)行檢測，從而獲得DNA序列。直接測序法是基因突變檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”，其優(yōu)點(diǎn)是結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可檢測整個(gè)測序范圍內(nèi)已知和未知突變點(diǎn)；缺點(diǎn)是步驟多，耗時(shí)長，靈敏度低，過程不易控制，在檢測已知突變位點(diǎn)方面將逐漸被熒光定量PCR法替代。
焦磷酸測序技術(shù)是一種新型的酶聯(lián)級(jí)聯(lián)測序技術(shù)，適于對已知的短序列進(jìn)行測序分析，其可重復(fù)性和精確性能與Sanger DNA測序法相媲美，而速度卻大幅提高。其原理是引物與模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶4種酶的協(xié)同作用下，將引物上每一個(gè)dNTP的聚合與一次熒光信號(hào)的釋放耦聯(lián)起來，通過檢測熒光的釋放和強(qiáng)度，達(dá)到實(shí)時(shí)測定DNA序列的目的。焦磷酸測序具備同時(shí)對大量樣品進(jìn)行測序分析的能力，具有高通量、低成本、適時(shí)、快速、直觀等優(yōu)點(diǎn)。
3、我國分子病理的臨床應(yīng)用領(lǐng)域
隨著分子病理技術(shù)的蓬勃發(fā)展，越來越多的疾病相關(guān)分子改變被發(fā)現(xiàn)并逐步應(yīng)用于臨床實(shí)踐中。自21世紀(jì)以來，分子病理診斷逐漸受到我國病理學(xué)工作者的認(rèn)可和重視，并逐步在大醫(yī)院病理科開展起來，特別是在遺傳性疾病、感染性疾病、腫瘤等方面分子病理診斷已取得了長足的進(jìn)步。
3．1 遺傳性疾病的診斷與分型??分子病理診斷在遺傳性疾病的診斷和分型方面凸顯特長，通過對患者染色體、基因的檢測進(jìn)行遺傳病篩查和診斷，并可對家族遺傳病的發(fā)生進(jìn)行預(yù)測。目前，國內(nèi)主要通過染色體核型分析、熒光原位雜交技術(shù)、熒光定量PCR技術(shù)等檢測染色體畸形，輔助進(jìn)行產(chǎn)前遺傳性疾病的篩查。通過DNA直接測序、熒光定量PCR、免疫組化技術(shù)等檢測相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)、表達(dá)的變化，輔助進(jìn)行神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等遺傳性疾病的診斷。
3．2感染性痰病病原體的檢測??在感染性疾病的臨床應(yīng)用方面，采用原位雜交、PCR-斑點(diǎn)雜交對人乳頭狀瘤病毒(HPV)DNA檢測，采用熒光定量PCR技術(shù)檢測結(jié)核桿菌DNA，采用PCR技術(shù)檢測各型肝炎病毒DNA或RNA，采用熒光定量PCR技術(shù)檢測人類單純皰疹病毒(HSV)DNA、肺SARS病毒RNA感染，采用原位雜交檢測EB病毒(EBV)編碼的小RNA(EBER)等，這些檢測已在感染性疾病的診斷及對療效進(jìn)行評價(jià)方面取得了很好的效果。
3．3腫瘤的病理診斷與臨床應(yīng)用??分子病理診斷目前在腫瘤的研究中應(yīng)用最為廣泛，已涉及到腫瘤易感基因檢測與早期診斷、腫瘤輔助診斷、個(gè)體化用藥伴隨診斷、腫瘤預(yù)后評估等多方面。單獨(dú)遺傳因素造成腫瘤的概率<5％。腫瘤的發(fā)生主要是遺傳基因和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，其中遺傳基因是內(nèi)因，與人體是否具有腫瘤易感基因有關(guān)。腫瘤易感基因檢測就是針對人體內(nèi)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的易感基因進(jìn)行的，它可以檢測出人體內(nèi)是否存在腫瘤易感基因或家族聚集性的致癌因素，根據(jù)個(gè)人情況給出個(gè)性化的指導(dǎo)方案。腫瘤易感基因檢測特別適合家族中有癌癥病例的人群，可以幫助這類人群提前了解自身是否存在腫瘤易感基因。已知的腫瘤易感性基因有Rbl、WTl、APC、BRCAl、hTERC和Ras等，分別與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、Wilms瘤、家族性腺瘤性息肉(FAP)、乳腺癌、宮頸癌、消化道腫瘤、泌尿系腫瘤、血液腫瘤等相關(guān)。采用DNA直接測序、熒光定量PCR、免疫組化技術(shù)等檢測相應(yīng)基因的改變，可評價(jià)個(gè)體患病風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)行疾病的早期預(yù)防和診斷。另外，通過熒光原位雜交技術(shù)檢測染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目的異常，也可早期發(fā)現(xiàn)膀胱癌、尿路上皮癌等惡性腫瘤的發(fā)生，篩選出腫瘤易感人群。腫瘤相關(guān)病原體的檢測，如HPV與宮頸癌，EB病毒與鼻咽癌、淋巴瘤，肝炎病毒與肝細(xì)胞癌等均可作為常規(guī)技術(shù)檢測，已在大醫(yī)院甚至中等規(guī)模醫(yī)院開展起來。
在腫瘤輔助診斷方面，目前在軟組織和骨腫瘤、淋巴造血系統(tǒng)腫瘤及腫瘤的分子分型中應(yīng)用最為成熟。在以滑膜肉瘤和骨外尤文肉瘤／外周原始神經(jīng)外胚層瘤為代表的一些軟組織腫瘤中，存在特異性的染色體易位及其相應(yīng)的融合性基因，采用熒光原位雜交技術(shù)可檢測這些具有腫瘤特征的染色體和融合性基因，不僅有助于了解腫瘤的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制，而且有助于臨床病理的診斷和鑒別診斷。使用BIOMED-2引物，以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的基因重排技術(shù)在淋巴瘤診斷中已占有非常重要的輔助診斷作用，而熒光原位雜交技術(shù)檢測染色體易位及其相應(yīng)的融合性基因已對淋巴造血系統(tǒng)腫瘤的分型、預(yù)后判斷、治療藥物的選擇具有決定性作用。如MALT基因斷裂檢測與黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤，bcl-2／IGH基因融合檢測濾泡性淋巴瘤，CCNDl／IGH融合基因與套細(xì)胞淋巴瘤，BCR／ABL融合基因確診慢性粒細(xì)胞白血病及指導(dǎo)格列衛(wèi)使用等。分子分型是乳腺癌研究中最為成熟的應(yīng)用，通過基因表達(dá)譜研究，可將乳腺癌分為管腔A型、B型，HER-2陽性型，基底樣型。
通過DNA直接測序、熒光定量PCR技術(shù)檢測基因突變、熒光定量PCR、免疫組化技術(shù)檢測基因表達(dá)、DNA直接測序、熒光定量PCR技術(shù)檢測基因多態(tài)性、熒光原位雜交技術(shù)檢測基因擴(kuò)增等，可指導(dǎo)腫瘤靶向治療、內(nèi)分泌治療和腫瘤個(gè)體化化療。目前應(yīng)用最為廣泛的如乳腺癌、胃癌HER-2基因的擴(kuò)增與化療方案的選擇，EGFR基因突變與肺癌靶向性酪氨酸激酶抑制劑(如易瑞沙、特羅凱)治療，EML4-ALK基因融合、ROSl基因重排、MET基因擴(kuò)增與克唑替尼治療，K-ras基因突變檢測篩選適合EGFR抑制劑治療的患者，C-kit、PDGFRA基因型預(yù)測imatinib治療的反應(yīng)，Top2A基因異常與化療療效，焦磷酸測序檢測MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化預(yù)測膠質(zhì)瘤中替莫唑胺的療效等。病理人家收集整理
基因表達(dá)譜研究在腫瘤預(yù)后評估方面起著巨大的推動(dòng)作用，如乳腺癌21基因檢測預(yù)測早期乳腺癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)及化療獲益情況，14基因與肺癌的預(yù)后。另外，諸如外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測與腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移等技術(shù)也逐步在國內(nèi)獲得應(yīng)用。
4、問題與對策
4．1 管理層面的問題
4．1．1發(fā)展不平衡??①地區(qū)發(fā)展不平衡：目前我國的分子病理檢查主要集中于大城市和經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)，邊遠(yuǎn)地區(qū)和經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)開展較少；②醫(yī)院發(fā)展不平衡：現(xiàn)在的情況是大醫(yī)院優(yōu)于小醫(yī)院，以三級(jí)甲等醫(yī)院為主，縣級(jí)以下醫(yī)院的分子病理幾乎為空白。雖然省級(jí)以上醫(yī)院大多開展了分子病理診斷，但有的醫(yī)院技術(shù)項(xiàng)目全面、系統(tǒng)，而有的醫(yī)院只開展了顯色原位雜交。不平衡的原因一是病理科主任對分子病理診斷的重要性認(rèn)識(shí)不到位，不主動(dòng)作為；二是臨床醫(yī)師對分子病理診斷的重要性認(rèn)識(shí)不到位，不支持不配合；三是醫(yī)院領(lǐng)導(dǎo)對分子病理診斷的重要性認(rèn)識(shí)不到位，不重視不投資。對此，行業(yè)協(xié)會(huì)如醫(yī)學(xué)會(huì)病理分會(huì)、醫(yī)院協(xié)會(huì)臨床病理管理專業(yè)委員會(huì)、醫(yī)師協(xié)會(huì)病理科醫(yī)師分會(huì)有責(zé)任做好宣傳和推動(dòng)工作，要利用各種機(jī)會(huì)和場合宣傳分子病理診斷對于臨床診斷和治療的重要意義，提高對分子病理診斷的認(rèn)識(shí)。衛(wèi)生部《病理科建設(shè)與管理指南(試行)》(衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)[2009]31號(hào))規(guī)定：三級(jí)綜合醫(yī)院病理科應(yīng)當(dāng)設(shè)置分子病理檢測室，為醫(yī)院病理科開展分子病理檢查提供了政策依據(jù)，病理科要抓住機(jī)遇，主動(dòng)作為。除三甲醫(yī)院外，如果其他醫(yī)療機(jī)構(gòu)具備開展分子病理檢查的軟硬件條件和標(biāo)本來源，也應(yīng)積極開展。
4．1．2秩序不健全??有的醫(yī)院將分子病理檢查項(xiàng)目放在在檢驗(yàn)科或中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。分子病理診斷是建立在組織和細(xì)胞基礎(chǔ)上的高技術(shù)項(xiàng)目，只有病理醫(yī)師才能在顯微鏡下識(shí)別所取的組織和細(xì)胞是否為病變組織或腫瘤組織，如果誤將正常組織和壞死組織當(dāng)做病變組織進(jìn)行檢查，勢必得到假陰性結(jié)果，不僅延誤診斷和治療，還給患者造成經(jīng)濟(jì)損失。在國外，分子病理檢查由病理科的分子遺傳實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)，技術(shù)人員具有分子生物學(xué)或遺傳學(xué)專業(yè)背景，檢查數(shù)據(jù)和資料由病理醫(yī)師綜合分析后出具報(bào)告。我國的分子病理檢查也應(yīng)由病理科承擔(dān)。目前除醫(yī)療機(jī)構(gòu)外，有的生物技術(shù)公司出于經(jīng)濟(jì)方面的考慮，也紛紛開展分子病理檢查項(xiàng)目，向社會(huì)出具分子病理檢測報(bào)告(不是診斷報(bào)告)。一方面，他們沒有病理醫(yī)師，不能獲得正確組織或細(xì)胞；另一方面，我國沒有實(shí)行檢查結(jié)果互認(rèn)，這種報(bào)告被醫(yī)療單位作為治療依據(jù)，如果因假陰性或假陽性給患者造成損失，責(zé)任難以劃定。我們認(rèn)為，生物技術(shù)公司可以利用自身的資金、設(shè)備和技術(shù)優(yōu)勢，與醫(yī)療機(jī)構(gòu)病理科聯(lián)合建立分子病理實(shí)驗(yàn)室，但最后報(bào)告應(yīng)由醫(yī)療單位的病理醫(yī)師簽發(fā)。
4．1．3收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)和醫(yī)保政策不配套??國家衛(wèi)計(jì)委已經(jīng)發(fā)布了42013版非營利性醫(yī)療服務(wù)項(xiàng)目》，共有9000余條收費(fèi)項(xiàng)目，其中包含了比較齊全的分子病理檢查收費(fèi)項(xiàng)目，各省正在加緊制訂收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)，2014
年上半年可望出臺(tái)。但是醫(yī)保部門尚未響應(yīng)。我們呼吁醫(yī)保部門盡快出臺(tái)相關(guān)政策，將分子病理檢查納入支付范圍。
4．2技術(shù)層面的問題
4．2．1技術(shù)平臺(tái)不規(guī)范??在已經(jīng)開展分子病理檢查的單位中，設(shè)備、設(shè)施和人員條件千差萬別，主要問題：①從事分子病理檢查醫(yī)師未經(jīng)過分子病理訓(xùn)練，只會(huì)照葫蘆畫瓢地出具檢查報(bào)告，不會(huì)正確解釋檢查結(jié)果，不會(huì)分析解決檢查過程中出現(xiàn)的技術(shù)問題，因而也不能指導(dǎo)技術(shù)員開展實(shí)驗(yàn)工作。②分子病理技術(shù)員大部分從病理組織學(xué)技術(shù)員轉(zhuǎn)行而來，只接受了簡單培訓(xùn)就開展工作，沒有分子生物學(xué)理論知識(shí)，沒有受過分子生物學(xué)技術(shù)的系統(tǒng)訓(xùn)練，只會(huì)照單抓藥，很難處理實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的意外情況。③設(shè)備不符合實(shí)驗(yàn)要求，比如移液器精度差，不定期校準(zhǔn)；用水浴鍋代替雜交儀；離心機(jī)轉(zhuǎn)速不準(zhǔn)，運(yùn)行不穩(wěn)定等等。④設(shè)施不符合實(shí)驗(yàn)要求。分子病理技術(shù)對實(shí)驗(yàn)室條件的要求與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室相同，需要潔凈的空氣、清潔的環(huán)境、合格的雙蒸餾水、標(biāo)準(zhǔn)的工作臺(tái)、規(guī)范的清洗間等。如果從事與PCR擴(kuò)增有關(guān)的分子病理檢查，為防止氣溶膠污染，還應(yīng)獨(dú)立設(shè)置標(biāo)本前處理區(qū)、試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。這些技術(shù)問題只能通過管理手段解決，即建立和實(shí)行分子病理檢查準(zhǔn)入制度。2012年云南省在全國率先將包括分子技術(shù)在內(nèi)的全部病理檢查技術(shù)納入二類技術(shù)管理，制訂了技術(shù)規(guī)范和準(zhǔn)入條件，所有已經(jīng)開展和準(zhǔn)備開展病理檢查的醫(yī)療單位都必須接受技術(shù)審核，審核結(jié)果由省衛(wèi)生廳發(fā)文公布，通過者辦理項(xiàng)目登記，準(zhǔn)予開展；未通過者不予登記，不得開展。該措施有力地促進(jìn)了云南省醫(yī)療單位病理科建設(shè)和發(fā)展。國家衛(wèi)計(jì)委病理質(zhì)控評價(jià)中心已組織有關(guān)專家制訂了《分子病理診斷實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)入基本要求》，對人員、技術(shù)、設(shè)備、設(shè)施的準(zhǔn)入以及實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)控、管理提出了明確要求。目前該文件正在征求相關(guān)人員和領(lǐng)導(dǎo)機(jī)關(guān)意見，相信該準(zhǔn)入制度的實(shí)施將有效規(guī)范全國分子病理實(shí)驗(yàn)室的建設(shè)。
4．2．2質(zhì)量控制和監(jiān)督不到位??以前開展分子病理檢查的單位，其質(zhì)量控制有的由本實(shí)驗(yàn)室自發(fā)進(jìn)行，缺乏室間比對和行業(yè)監(jiān)督；有的則根本不進(jìn)行質(zhì)量控制。這種情況直接影響分子病理檢查結(jié)果的可信度，也是有些單位的分子病理檢查得不到，臨床認(rèn)可的重要原因。衛(wèi)計(jì)委病理質(zhì)控評價(jià)中心依托復(fù)旦大學(xué)腫瘤醫(yī)院開展了2批EGFR突變檢測的質(zhì)控，取得很好效果，但參加單位均是出于自覺，對不參加的單位或參加但不合格的單位沒有懲戒措施。要想徹底解決這一問題，必須建立全國統(tǒng)一的分子病理質(zhì)控體系，制訂質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)和獎(jiǎng)懲措施，由衛(wèi)生行政部門發(fā)布、質(zhì)控中心組織實(shí)施和監(jiān)督。病理人家收集整理
4．3拓展問題
4．3．1應(yīng)用范圍的拓展??如上所述，目前分子病理診斷只應(yīng)用于部分領(lǐng)域，還有許多疾病與分子病理診斷無緣，主要原因是我們不知道這些疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中存在何種分子遺傳學(xué)變化。我們相信，隨著對疾病發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制深入研究，必將有一些關(guān)鍵的基因變化被揭示出來，分子病理診斷的范圍必將由此而延伸?，F(xiàn)階段的分子病理診斷主要是單個(gè)標(biāo)記物的檢測，但疾病的發(fā)生特別是腫瘤是眾多基因共同作用的結(jié)果，采用單基因標(biāo)記物進(jìn)行診斷很難滿足個(gè)體化診斷要求。因此分子病理診斷可能從單基因檢測過渡到多基因檢測甚至全基因組的檢測，到那時(shí)可根據(jù)患者的遺傳背景制定個(gè)體化治療方案，從而提高疾病預(yù)防和治療的效率。
4．3．2技術(shù)的拓展??盡管已經(jīng)建立的分子生物學(xué)技術(shù)很多，但真正在分子病理診斷中應(yīng)用的只有幾種。一種技術(shù)從實(shí)驗(yàn)室走向臨床需解決技術(shù)的特異性、敏感性和穩(wěn)定性問題。隨著技術(shù)的轉(zhuǎn)化，將會(huì)有越來越多的分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于臨床。PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)、聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(RFLP-PCR)、低變性溫度下的復(fù)合PCR(COLD-PCR)技術(shù)、富集突變法PCR法、高分辨率溶解曲線、變性高效液相色譜、PCR芯片等技術(shù)將逐漸應(yīng)用于病理診斷和分型，指導(dǎo)靶向治療、預(yù)測治療反應(yīng)和判斷預(yù)后，成為常規(guī)的分子病理診斷技術(shù)。為了節(jié)約成本和時(shí)間，高通量分子病理檢測技術(shù)將是重要的發(fā)展方向。
